大肠杆菌利用甘油生产C4-二羧酸类物质的代谢工程研究

摘要

甘油作为生物柴油产业的主要副产物，日益成为一种廉价、可持续的生物发酵工业的原料和底物。C4-二羧酸类物质（琥珀酸、富马酸和苹果酸）在食品、制药、化工等领域都有非常广泛的应用。本文通过代谢工程和进化工程的策略构建了能够利用甘油为底物高效生产C4-二羧酸类物质的大肠杆菌菌株。
　　首先利用基元模式分析的方法对大肠杆菌在好氧、微氧和厌氧条件下利用甘油为底物生产琥珀酸的代谢网络模型分别进行了系统的计算和分析。
　　根据基元模式分析的结果，构建了好氧琥珀酸生产菌株，琥珀酸的得率达到0.22 mol/mol甘油，但副产物α-酮戊二酸会大量积累。通过对敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的菌株进行适应性进化，提高了乙醛酸循环的通量，进而使得α-酮戊二酸的产量降低了46％，琥珀酸的得率提高了30%。通过过表达α-酮戊二酸脱氢酶，进一步大大降低了α-酮戊二酸的产量，并将琥珀酸的得率提高了20%，达到了好氧发酵最大理论得率的67%。此外，异柠檬酸脱氢酶的编码基因icdA的编码区在进化过程中发生了错义突变G583T。通过将该突变引入对照菌株，大大提高了琥珀酸的得率，说明该突变是造成乙醛酸循环通量提高的主要原因。通过进化工程和代谢工程策略构建的菌株E2-Δsdh-ppc-sucAB在1L的发酵罐中通过补料分批发酵，能够消耗120 g/L甘油产生43.2 g/L琥珀酸。
　　以构建的好氧条件下的琥珀酸高产菌株为基础，通过敲除三个富马酸酶，成功地使大肠杆菌能够利用甘油为底物生产富马酸，但会大量积累副产物乙酸。为了降低副产物乙酸的积累，尝试了多种代谢工程方法。其中通过过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或乙醛酸循环操纵子来提高回补途径的通量，能有效的降低乙酸和提高富马酸的产量。在1L的发酵罐中通过补料分批发酵方式，菌株EF02(pSCppc)共消耗了94 g/L甘油，产生了41.5 g/L富马酸，富马酸的得率达到最大理论得率的70%。
　　基于基元模式分析，构建了大肠杆菌在微氧条件下利用甘油生产琥珀酸的菌株，并在此基础上通过进一步的代谢工程策略构建了利用甘油生产苹果酸的菌株，并研究了多个途径对苹果酸生产的影响。最终菌株在微氧条件下的琥珀酸产量和得率分别达到11.5 g/L和0.64 mol/mol甘油。苹果酸生产菌株的苹果酸产量和得率分别达到7.5 g/L和0.57 mol/mol甘油。

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第一章 文献综述

1.1 C4-二羧酸及其应用

1.2 C4-二羧酸的化学合成法

1.3 C4-二羧酸的生物合成法

1.4 甘油及其利用

1.5 利用甘油生产C4-二羧酸

1.6 基元模式分析

1.7 代谢工程与进化工程的结合

1.8 选题背景及研究思路

第二章 大肠杆菌利用甘油生产琥珀酸的基元模式分析

2.1 实验方法

2.2 实验结果与讨论

2.3 本章小结

第三章 大肠杆菌在好氧条件下利用甘油生产琥珀酸

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 大肠杆菌在好氧条件下利用甘油生产富马酸

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 大肠杆菌在微氧条件下利用甘油生产琥珀酸和苹果酸

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 实验结果与讨论

5.4 本章小结

第六章 结论与展望

6.1 结论及创新点

6.2 展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

附录

致谢