肺炎克雷伯氏杆菌利用甘油产3-羟基丙酸的代谢工程研究

摘要

平台化合物3-羟基丙酸（3-Hydroxypropionic acid，3-HP）因其良好的化学变通性近年来受到了极大的关注。传统的化学法生产3-羟基丙酸因环境污染大、成本高等因素，制约了该化合物的广泛使用。近来，生物法从甘油合成3-羟基丙酸因其良好的环境兼容性及低成本的底物价格优势，成为未来生产3-羟基丙酸工业化生产的可行道路。肺炎克雷伯氏杆菌因其较快的生长速度及较高的甘油耐受性，成为了3-羟基丙酸生产的首选宿主菌。本研究针对肺炎克雷伯氏杆菌进行了一系列代谢工程的改造，使其3-羟基丙酸的生产能力得到了大幅度提升，同时也对该平台菌种进行了基础研究，完善了该非模式菌中的分子操作技术，主要包括以下内容。
　　1、针对3-HP生产中的两个关键酶甘油脱水酶(GDHt)和醛脱氢酶(ALDH)的酶活差异导致的生产不平衡性，在K.pneumoniae中构建三种载体，将两者的编码基因dhaB和ald4用三种不同的方式进行连接，即dhaB优先表达、ald4优先表达及两基因分别用各自的启动子同时表达。结果发现，摇瓶中优先表达ald4的重组K.pneumoniae的3-HP产量最高，在24 h达2.14 g/L，相比于其他两株菌，该菌ALDH酶活为最高，为35.16 U/mg，而GDHt酶活最低。该结果表明，平衡后的表达方式增加了3-HP生产能力，减少了中间产物的积累。接着测试了来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的ald4、来自E.coli的aldH和来自K.pneumoniae的puuC基因编码的ALDH在K.pneumoniae中的催化活性。结果表明，puuC基因编码的ALDH具有较高的活性，其酶活达到了50.35 U/mg。工程菌K.pneumoniae(PB-puuC)在摇瓶中的3-HP产量达到7.21 g/L，5L发酵罐中达到20g/L，展现出了较大的生产潜力。
　　2、为了提高ALDH在K.pneumoniae中的酶活，在K.pneumoniae中进行了再生NAD+的研究。寻找了来自S.cerevisiae中甘油3-磷酸脱氢酶编码基因GPD1、来自K.pneumoniae中NADH脱氢酶编码基因nadh及来自K.pneumoniae中NADH氧化酶编码基因naox体内表达催化NADH变为NAD+。结果表明，NADH氧化酶有着最高的NAD+再生活性，其酶活达到57 U/mg。构建含有NAD+再生及ALDH共表达载体的K.pneumoniae后，重组菌Kp(NALD)展现出活性最高的NAD+再生活力，达到40.84 U/mg，且相应的ALDH活性也有了较大提高，达55.51 U/mg。但发酵结果显示，含有NADH氧化酶载体的重组Kp(OXLD)的3-HP产量最高，24 h时达2.12 g/L，且由于辅酶的操控，该重组菌的生物量比对照组提高了8％，OD600达到了1.5。本实验通过体内调节辅酶比例，调整了代谢流的流向及生物量的积累，且寻找到了副反应最小的NADH氧化酶为后续提升产量奠定了基础。
　　3、依照假单胞菌Pseudomonas sp.AIU362中编码NAD+不依赖型的醛氧化酶AOX基因序列人工合成了888 bp的alod基因，连接至pET-28a和pET-pk载体上，分别转化至E.coli及K.pneumoniae中表达。SDS-PAGE显示AOX在两宿主菌内均得到了较好表达。经测定，AOX对正丙醛及3-羟基丙醛(3-HPA)的酶活分别达到了16.6U/mg及13.7 U/mg，初步证明了AOX催化3-HPA合成3-HP的可能性。经双倒数法测定，AOX对3-羟基丙醛的Km值和Vmax值分别达到了6.68 mM和41.8μ mol/min/mg。分子模拟结果显示其与ALDH存在着较大的结构上的差异。重组菌K.pneumoniae(pk-alod)的摇瓶发酵结果显示，3-HP产量在24 h达到0.85 g/L，对照组为0.6 g/L。后续上罐发酵中，K.pneumoniae(pk-alod)的3-HP产量在24 h达到3 g/L。这是国内外首次使用NAD+独立型醛氧化酶进行3-HP的生产。
　　4、利用合成生物学中的MAGE技术，对非模式菌种K.pneumoniae进行了大规模的基因组改造。首先构建了外源稳定表达λRed系统重组酶的质粒pET-Red及敲除K.pneumoniae乳酸脱氢酶基因的载体pET-ud-ldh，分别使用Red系统及RecA系统敲除了dhaT基因及ldh基因，并在dhaT基因的位置上用aldH基因代替，构建了平台工程菌Kpac。利用Kpac为宿主进行了单链介导的重组，重构了多于30条甘油相关代谢途径。最终筛选了201株菌进行3-HP产量的测定，筛选出一株3-HP产量最高的宿主菌，并命名为Kp3。经酶活检测，Kp3的ALDH、GDHt和PDOR的酶活分别达到3.83 U/mg、11.17 U/mg和3.94 U/mg，均高出K.pneumoniae及Kpac。测序结果显示Kp3的突变发生在另一个ldh基因和poxB基因上，编码了3-HP生产中产生副产物乳酸及乙酸的关键酶。在无抗生素及诱导剂加入的情况下，Kp3在摇瓶中3-HP产量可达到0.6 g/L，在5L发酵罐中3-HP产量达6.39 g/L。之后测试并利用反义mRNA技术抑制了K.pneumoniae中的乳酸及乙酸的代谢流，并同时引入了aldH基因以提升3-HP的合成能力。结果表明，相对于只表达aldH的Kp(pET-aldH)，引入乳酸和乙酸的反义模块的重组菌Kp(pET-rLB-aldH)乳酸及乙酸的产量有了明显的降低，同时该重组菌3-HP产量得到了提高。该现象说明3-HP的生产与副产物乳酸乙酸的生成为相互竞争的关系，并未后续提高3-HP的产量提供了思路。
　　5、为了提高K.pneumoniae的3-HP生产能力，对重组K.pneumoniae进行了组合优化。寻找了组成型的lac启动子及诱导性的tac启动子，分别连接在pUC19及pET-28a载体上，表达K.pneumoniae自身的puuC基因，构建了重组菌K.pneumoniae(puck-puuC)和K.pneumoniae(ptac-puuC)。利用组成型产3-HP的菌种K.pneumoniae(puck-puuC)优化了甘油发酵培养基，最佳成分为K2HPO4·3H2O5.1 g/L,KH2PO41.95 g/L,(NH4)2 SO48g/L,MgSO4·7H2O0.125 g/L，酵母粉4 g/L。利用诱导性3-HP生产菌K.pneumoniae(ptac-puuC)优化了IPTG浓度和发酵pH值，最终分别确定为0.02 mM及pH7。摇瓶发酵测定两株工程菌的代谢流量，发现在tac启动子的作用下，重组菌K.pneumoniae(ptac-puuC)减少了1，3-丙二醇及2，3-丁二醇的代谢流量，同时增加了3-HP的代谢流量，其3-HP产量达2.93 g/L。在优化后的培养条件下经过精细的发酵调控，重组菌的3-HP产量达到73.4 g/L，甘油转化率达到52％，在副产物乳酸及乙酸有了较大幅度降低的同时，高值化合物1，3-丙二醇及2，3-丁二醇也有17.9 g/L和20g/L的产生，为联产高价值化合物提供了良好的基础。为进一步增加3-HP产量，同时减少乳酸及乙酸的产量，利用RecA重组技术构建了3个打靶载体，敲除了ldh、lldd及pta基因，得到宿主菌KpF。将tac-puuC质粒转化，得到重组菌KpF(ptac-puuC)。上罐发酵结果显示，该重组菌在72 h内3-HP合成量达到了83.8 g/L，甘油转化率达54％，同时有着较少的乳酸和乙酸的产生，展现出了极大的工业化生产前景。Real-Time PCR分析结果显示，诱导tac启动子后，K.pneumoniae自身的RNA聚合酶及其相关元件编码基因都有2倍以上转录强度的增强，证明了tac启动子在K.pneumoniae中的适配性，为后续改造K.pneumoniae生产化合物提供了良好的基础。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 3-羟基丙酸概述

1．2 3-HP的化学合成方法

1．3 3-HP的生物合成方法

1．4 可产生3-HP的菌种

1．5 肺炎克雷伯氏杆菌

1．6 K．pneumoniae的甘油代谢途径

1．7 生物法合成3-HP的研究进展

1．7．1 大肠杆菌为宿主

1．7．2 K．pneumoniae为宿主的3-HP研究进展

1．8 合成生物学

1．8．1 MAGE技术

1．9 基因定向敲除技术

1．9．1 RecA系统介导的基因敲除

1．9．2 λRed系统介导的基因敲除

1．10 本研究立项的意义

第二章 关键酶体内排列顺序对3-HP生产的研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株与质粒

2．2．2 试剂与仪器

2．2．3 培养基

2．3 实验方法

2．3．1 K．pneumoniae基因组的提取

2．3．2 E．coli中质粒载体的提取

2．3．3 PCR反应扩增目的基因片段

2．3．4 PCR产物回收目的基因

2．3．5 琼脂糖切胶回收

2．3．6 酶切连接的反应体系

2．3．7 化学法热转化E．coli

2．3．8 电转化重组质粒至K．pneumoniae

2．3．9 发酵重组K．pneumoniae

2．3．10 酶活的测定方法

2．3．11 代谢物的测定方法

2．4 结果与讨论

2．4．1 K．pneumoniae基因组的提取

2．4．2 dhaB、aldH、puuC、ald4及pkald4的克隆

2．4．3 dhaB、aldH、puuC、ald4及pkald4的连接转化

2．4．4 酶活的测定

2．4．5 摇瓶发酵的产3-HP的研究

2．4．5 K．pneumoniae(PB-puuC)上罐发酵的研究

2．5 本章小结

第三章 引入NAD+再生途径对ALDH酶活及3-HP代谢的影响

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌株、质粒和引物

3．2．2 仪器、试剂和培养基

3．3 实验方法

3．4 结果与讨论

3．4．1 质粒的提取及基因的克隆

3．4．2 基因与载体的连接与转化

3．4．3 酶活的测定

3．4．4 重组菌的发酵

3．5 本章小结

第四章 利用NAD+不依赖型的醛氧化酶产3-HP的研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌种、质粒和引物

4．2．2 仪器、试剂和培养基

4．3 实验方法

4．3．1 AOX酶活的测定

4．3．2 分子模拟

4．3．3 SDS-PAGE分析

4．4 结果与讨论

4．4．1 质粒的提取及基因的克隆

4．4．2 alod基因与载体的连接与转化

4．4．3 酶活的测定及SDS-PAGE

4．4．4 摇瓶发酵重组K．pneumoniae产3-HP

4．4．5 上罐发酵重组K．pneumoniae(pET-pk-alod)

4．5 本章小结

第五章 利用单链核苷酸介导K．pneumoniae基因组重组

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 菌株、质粒和引物

5．2．2 仪器、培养基和试剂

5．3 实验方法

5．3．1 ldh基因的敲除

5．3．2 dhaT基因的敲除

5．3．3 单链介导的重组

5．3．4 反义mRNA技术验证产物间的关系

5．4 实验结果

5．4．1 基因的克隆及转化

5．4．2 dhaT及ldh基因的敲除

5．4．3 利用单链核苷酸重组K．pneumoniae染色体

5．4．4 重组菌Kp3的摇瓶发酵

5．4．5 Kp3的上罐发酵

5．4．6 利用反义mRNA技术验证3-HP及副产物代谢的关系

5．5 本章小结

第六章 组合优化重组K．pneumoniae高效生产3-HP

6．1 引言

6．2 实验材料

6．2．1 菌株、引物和质粒

6．2．2 仪器、培养基和试剂

6．3 实验方法

6．4 实验结果与讨论

6．4．1 基因的克隆，连接及转化

6．4．2 甘油发酵培养基的优化

6．4．3 IPTG加入量对诱导型3-HP工程菌的影响

6．4．4 组成型与诱导型3-HP生产的效率比较

6．4．5 SDS-PAGE分析及酶活的测定

6．4．6 发酵液pH值的优化

6．4．7 延长重组菌发酵周期高产3-HP

6．4．8 敲除副产物基因集中3-HP代谢流

6．4．9 Real-Time PCR分析tac启动子的适配性

6．5 本章小结

第七章 总结与展望

7．1 总结

7．2 创新点

7．3 展望

参考文献

附录

致谢

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