以甘油为底物构建肺炎克雷伯氏重组菌生产3-羟基丙酸

摘要

3-羟基丙酸(3-HP)是一种重要的平台化合物，其生物合成方法与工业化程度引起了广泛的重视。本文选取具有高浓度甘油耐受力的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)作为3-HP的生产宿主，以K.pneumoniae的组成型启动子分别构建了醛脱氢酶基因ald4与甘油脱水酶基因dhaB的串联共表达质粒pKP-28a-AB，经SDS-PAGE分析，重组菌的关键酶基因得以有效表达。摇瓶批式发酵显示，重组菌K. pneumoniae(pKP-28a-AB)在有氧条件下，3-HP产量为0.336 g·L-1，甘油转化率为0.1(mol·mol-1 glycerol)。
　　 以关键酶共表达质粒pKP-28a-AB，分别转化1，3-丙二醇高产菌株K.pneumoniae K2与乳酸脱氢酶基因敲除菌株K. pneumoniae Kp5-3，获得的重组菌K2-AB与Kp5-3-AB经初步发酵分析显示，重组菌K2-AB在小试条件下的3-HP产量为3.09 g·L-1，甘油转化率为0.68(mol·mol-1 glycerol)，相比已构建的重组菌具有最高的3-HP生成量；重组菌Kp5-3-AB的摇瓶批式发酵结果显示，3-HP浓度相比对照菌株提高了～1倍，乳酸浓度降低了～1倍。
　　 建立了两种消除K. pneumoniae重组型质粒的方法：连续传代法与SDS法。其中，用0.2％SDS复合Ca2+处理K. pneumoniae，能有效消除其重组型质粒，获得的质粒消除菌可再次导入新的质粒。利用建立的质粒消除方法，初步研究了抗性胁迫条件对重组菌生产3-HP的影响，发酵分析显示，新构建的重组菌3-HP生成量相比同基因型的对照菌株提高了24.57％。
　　 利用合成生物学领域新兴的应用，设计了构建“细胞工厂”的五个通用研究步骤。将DNA组装技术引入实验，以Polymerase cycling assembly(PCA)的方法研究质粒构建的问题，并依靠两个线性DNA片段构建出～4.5kb的完整质粒，为实现快速有效的非连接酶克隆体系做出有益尝试。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章 绪论

1.1 3-羟基丙酸概况

1.1.1 3-羟基丙酸理化性质与用途

1.1.2 3-羟基丙酸的生产方法

1.2 3-羟基丙酸的生物合成途径

1.2.1代谢途径设计

1.2.2以葡萄糖为底物

1.2.3以甘油为底物

1.3生产菌种

1.4生理工程简介

1.5合成生物学与DNA组装技术简介

1.5.1引言

1.5.2体内组装DNA策略

1.5.3体外组装DNA策略

1.6本课题的立项意义

第二章 酿酒酵母醛脱氢酶ald4基因的克隆

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1菌株与质粒

2.2.2试剂与仪器

2.2.3培养基

2.3实验方法

2.3.1酿酒酵母S.cerevisiae基因组DNA的提取

2.3.2聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因ald4

2.3.3琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离目的基因ald4

2.3.4 TA克隆构建质粒pMD 18-T-ald4

2.3.5质粒pMD 18-T-ald4转化大肠杆菌

2.3.6质粒pMD 18-T-ald4的鉴定

2.3.7质粒pKP-28a-ald4的构建

2.3.8质粒pKP-28a-ald4的鉴定

2.3.9重组质粒pKP-28a-ald4电击法转化K.pneumoniae

2.4结果与讨论

2.4.1 S.cerevisiae基因组DNA的提取

2.4.2聚合酶链式反应扩增基因ald4

2.4.3 T载体重组子的鉴定

2.4.4 ald4基因的序列测定与分析

2.4.5重组表达载体pKP-28a-ald4的构建与鉴定

2.5本章小结

第三章　共表达醛脱氢酶与甘油脱水酶基因及产3-羟基丙酸研究

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1菌株、质粒、引物

3.2.2试剂与仪器

3.2.3培养基

3.3实验方法

3.3.1质粒pKP-28a-dhaB的构建

3.3.2 ald4与dhaB基因串联共表达质粒的构建

3.3.3质粒载体的去磷酸化

3.3.4 PCR方法快速鉴定重组体DNA插入方向

3.3.5重组质粒pKP-28a-AB电击法转化K.pneumoniae

3.3.6醛脱氢酶基因ald4与甘油脱水酶基因dhaB在K.pneumoniae中的表达

3.3.7重组菌的发酵培养

3.3.8高效液相色谱(HPLC)检测3-羟基丙酸产物浓度

3.3.9改进的高碘酸钠氧化法[34]测定发酵液中的甘油浓度

3.4结果与讨论

3.4.1质粒pKP-28a-dhaB的构建

3.4.2 ald4-EcoR I-SD基因的克隆

3.4.3 PCR方法快速鉴定重组体DNA插入方向

3.4.4串联共表达质粒pKP-28a-AB的鉴定

3.4.5重组菌共表达ald4与dhaB基因

3.4.6重组菌K.pneumoniae(pKP-28a-AB)以甘油为底物发酵生产3-羟基丙酸

3.5本章小结

第四章 重组菌K.pneumoniae生产3-羟基丙酸的研究

4.1引言

4.2实验材料

4.2.1菌株与质粒

4.2.2试剂与仪器

4.2.3培养基

4.3实验方法

4.3.1发酵条件与培养方法

4.3.2发酵参数测定与分析

4.4结果与讨论

4.4.1重组菌K.pneumoniae K2-AB的发酵特性

4.4.2重组菌K.pneumoniae K2-AB的放大培养研究

4.4.3重组菌K.pneumoniae Kp5-3-AB的产3-羟基丙酸研究

4.5本章小结

第五章 消除K.pneumoniae重组型质粒的方法与应用

5.1引言

5.2实验材料

5.2.1菌株与质粒

5.2.2试剂与仪器

5.2.3培养基

5.3实验方法

5.3.1连续传代法消除K.pneumoniae质粒

5.3.2 SDS方法消除K.pneumoniae质粒

5.3.3质粒的再导入

5.3.4质粒消除在生理工程中的应用

5.3.5种子发酵培养

5.4结果与讨论

5.4.1连续传代培养对质粒消除的影响

5.4.2 SDS方法消除重组质粒

5.4.3质粒消除菌重新导入新质粒

5.4.4质粒消除方法在生理工程中的应用

5.5本章小结

第六章　DNA快速组装技术的理论研究与应用

6.1引言

6.2实验材料

6.2.1菌株、质粒

6.2.2试剂与仪器

6.2.3培养基

6.3实验方法

6.3.1大肠杆菌E.coli基因组的提取

6.3.2大肠杆菌E.coli K-12 aldH基因的准备

6.3.3线性化质粒骨架的准备

6.3.4 Polymerase cycling assembly(PCA)连接质粒骨架与插入基因

6.4结果与讨论

6.4.1利用DNA组装技术构建“细胞工厂”

6.4.2大肠杆菌Ecoli K-12基因组DNA的提取

6.4.3大肠杆菌Ecoli K-12 aldH基因的克隆

6.4.4质粒骨架pKP-28a-dhaB的线性化

6.4.5重组质粒pKP-28a-BH阳性克隆子的鉴定

6.5本章小结

第七章 实验总结与建议

7.1主要结论

7.2问题与建议

参考文献

附录

致谢