工程大肠杆菌合成姜黄素与四氢姜黄素

摘要

姜黄素类是姜科植物的天然产物，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗艾滋病和抗阿尔兹海默综合症等多种生理活性，应用于医药和食品行业。本文中以阿魏酸为前体，采用合成生物学和代谢工程的策略，在大肠杆菌中构建姜黄素和四氢姜黄素的生物合成途径，通过不同基因之间的适配性优化、发酵pH和碳源优化以及增强丙二酰辅酶A和还原力供给等策略，提高目标产物的合成能力。
　　选择植物和微生物来源的3个酰基辅酶A连接酶和2个姜黄素合成酶基因元件，进行组合和拷贝数适配。结果表明中等拷贝数表达At4CL和CUS组合产量高，可达19.6mg/L。使用甘油为碳源，pH稳定在6左右，显著地提高了姜黄素的产量，可达94.81mg/L。进一步增加胞内丙二酰辅酶A供给，得到了姜黄素高产菌株，其产量可达179.7mg/L。
　　在大肠杆菌中过表达7个还原酶基因，其中4种酶能够催化姜黄素合成四氢姜黄素。根据CurA酶学特性，构建pntAB、udhA、g6pdh过表达载体，以增加NADPH供给。以0.1mM姜黄素为前体，过表达g6pdh，生成25.1mg/L四氢姜黄素，使CurA催化效率从52％提升至68%。
　　本课题构建了产姜黄素、四氢姜黄素的代谢途径，优化了发酵条件和增强NADPH供给，实现了从阿魏酸到姜黄素和四氢姜黄素的合成，为工程大肠杆菌合成其他植物源化合物提供了新思路。

目录

声明

前言

第一章 文献综述

1.1姜黄素的发现及其理化性质

1.1.1姜黄素的发现

1.1.2姜黄素的理化性质

1.2姜黄素类化合物的活性及其应用

1.2.1 姜黄素类化合物的活性

1.2.2姜黄素类化合物的应用

1.3姜黄素类化合物的生产方法

1.3.1植物提取制备姜黄素

1.3.2化学合成制备姜黄素

1.3.3生物转化法制备姜黄素类化合物

1.4姜黄素的生物合成

1.4.1姜黄素类化合物的生物合成途径解析

1.4.2姜黄素合酶

1.4.3姜黄素类化合物的代谢工程改造

1.5本文的主要研究内容和意义

1.5.1本文的主要研究内容

1.5.2本文的主要研究意义

第二章 姜黄素的合成途径构建及优化

2.1实验材料与方法

2.1.1实验菌株与质粒

2.1.2实验所用主要试剂与引物

2.1.3培养基配方与培养方法

2.1.4 表达载体的构建及转化

2.1.5 发酵中生物参数的检测

2.1.6 姜黄素检测方法

2.2结果与讨论

2.2.1从阿魏酸到姜黄素合成途径的建立及优化

2.2.2 发酵培养基pH对姜黄素生产的影响及控制

2.2.3 发酵碳源对姜黄素生产的影响

2.2.4 丙二酰辅酶A含量对姜黄素生产的影响

2.2.5 以L-酪氨酸为底物生产姜黄素

2.3本章小结

第三章 四氢姜黄素的合成途径构建及优化

3.1实验材料与方法

3.1.1实验所用菌株与质粒

3.1.2实验所用试剂及引物

3.1.3 培养基与培养方法

3.1.4 四氢姜黄素检测方法

3.2结果与讨论

3.2.1 四氢姜黄素合成表达载体的构建

3.2.2 四氢姜黄素合成途径验证

3.2.3 NADPH供给对于CurA催化效率的影响

3.3本章小结

第四章 结论与展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢