番茄NAC转录因子与脱落酸、乙烯的关系研究

摘要

NAC转录因子是在植物中发现的一类特有的转录因子，具有多种生物功能。前期研究表明，NAC转录因子参与番茄果实生长发育及色素合成。本文采用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）对番茄中SNAC4/9基因沉默，系统分析NAC转录因子与ABA的关系，主要的研究结果如下： 1.转录组测序结果表明：（1）在沉默SNAC4和SNAC9的番茄果实中，分别有1262和655个基因显著差异表达。从脱落酸代谢途径及参与成熟途径的通路入手，在沉默SNAC4的番茄果实中，筛选出17个显著富集通路，26个差异表达基因，并挑选出4个基因用于验证；在沉默SNAC9的番茄果实中，筛选出16个显著富集通路，30个差异表达基因，并挑选出6个基因用于验证。PCR验证结果与转录组测序结果基本一致，证明转录组测序所获得的数据可靠。 2.沉默番茄果实生理生化指标表明：沉默SNAC4/9显著抑制乙烯的产生，沉默SNAC4抑制果实软化及ABA的积累，而抑制SNAC9呈现相反趋势。 3.ABA合成与代谢相关基因转录水平检测结果表明：沉默SNAC4/9基因影响番茄果实ABA合成代谢。沉默SNAC4基因会导致ABA合成相关基因（NCED1/2）及受体基因下调，而代谢相关基因（CYP707A1/2/3）呈现上调趋势；沉默SNAC9基因果实的ABA合成代谢呈现出相反趋势。 4.激素处理果实生理生化结果表明：ABA处理绿熟期番茄果实会诱导ABA及乙烯的合成，而ABA抑制剂NDGA显著抑制ABA和乙烯的合成。 基因表达结果表明：ABA处理会导致乙烯和ABA合成关键基因表达上调，NDGA下调其表达，ABA+1-MCP处理导致乙烯合成关键基因下调、ABA合成关键基因上调、ABA代谢关键基因下调，表明1-MCP能够抑制乙烯生物合成，但不影响ABA合成，ABA在果实软化上发挥重要作用。 综上所述，沉默SNAC4和SNAC9转录因子均能够抑制乙烯的释放，分别抑制和促进ABA的合成及软化进程，NAC4/9转录因子可能通过影响ABA的合成代谢进而影响果实成熟软化。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 转录组测序技术

1.1.1 转录组测序技术的原理

1.1.2 转录组测序技术的特点

1.1.3 转录组测序技术在植物中的应用

1.2 NAC转录因子研究进展

1.2.1 NAC转录因子结构域和分类

1.2.2 NAC转录因子的功能

1.3 脱落酸与乙烯调控果实成熟研究进展

1.3.1 脱落酸生物合成的研究进展

1.3.2 脱落酸分解代谢的研究进展

1.3.3 脱落酸受体及信号转导研究进展

1.3.4 脱落酸调控果实成熟

1.3.5 乙烯调控果实成熟

1.3.6 脱落酸与乙烯共同调控果实成熟

1.4 果实成熟过程中的细胞壁代谢

1.4.1 果胶甲基酯酶（PME）

1.4.2 多聚半乳糖醛酸酶（PG）

1.4.3 纤维素酶（Celluase）

1.4.4β-半乳糖苷酶（β-Gal）

1.4.5 木葡聚糖内糖基转移酶（XET）

1.4.6 扩展蛋白（EXP）

1.5 病毒诱导基因沉默技术

1.6 本研究的目的和意义

1.7 主要研究内容和技术路线

1.7.1 主要研究内容

1.7.2 技术路线

第二章 基于转录组测序的脱落酸相关通路分析

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 实验仪器

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 实验器具灭酶处理

2.1.6 常用试剂的配制

2.2 实验方法

2.2.1 RNA-seq高通量测序

2.2.2 原始测序数据预处理

2.2.3 参考序列比对分析

2.2.4 测序质量评估

2.2.5 转录本差异表达分析

2.2.6 聚类分析

2.2.7 GO富集分析

2.2.8 KEGG富集分析

2.2.9 参考物种信息

2.2.10 引物的设计与合成

2.2.11 果实总RNA的提取及检测

2.2.12 RNA的消化及cDNA第一条链的合成

2.2.13 实时荧光定量PCR

2.3 结果与分析

2.3.1 差异表达分析

2.3.2 GO富集分析

2.3.3 KEGG富集分析

2.3.4 沉默SNAC4/9代谢通路的基因筛选

2.3.5 沉默SlNAC4/9基因脱落酸相关代谢通路聚类热图分析

2.3.6 PCR扩增目标基因及内参基因β-tublin

2.3.7 目标基因在沉默SlNAC4/9下的表达特性。

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 VIGS沉默SlNAC4/9番茄果实的成熟生理生化变化

3.1 实验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 菌株

3.1.3 主要试剂

3.1.4 主要仪器设备

3.1.5 常用试剂及培养基的配制

3.2 实验方法

3.2.1 侵染农杆菌液的制备

3.2.2 番茄植株的侵染

3.2.3 乙烯含量测定

3.2.4 果实硬度测定

3.2.5 ABA含量测定

3.3 结果与分析

3.3.1 沉默SNAC4/9番茄果实乙烯生成量及ABA含量的变化研究

3.3.2 沉默SNAC4/9番茄果实硬度的变化研究

3.4 讨论

3.5 本章小结

第四章 SANC4/9与ABA合成代谢相关基因关系研究

4.1 实验材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 菌株

4.2 实验方法

4.2.1引物的设计与合成

4.3 结果与分析

4.3.1目的基因片段的PCR扩增

4.3.2 ABA合成关键基因NCED1/2的表达研究

4.3.3 ABA代谢关键基因CYP707A1/2/3的表达研究

4.3.4 ABA受体PYL9的表达研究

4.3.5 PP2C1与SnRK2.2的表达研究

4.3.6泛素结合酶基因E2-like及连接酶基因E3的表达研究

4.4 讨论

4.5 本章小结

第五章 激素处理对番茄果实的生理生化变化研究

5.1 实验材料

5.1.1 植物材料

5.1.2 主要试剂

5.1.3 主要仪器设备

5.1.4 主要试剂的配制

5.2 实验方法

5.2.1 外源ABA、NDGA及ABA+1-MCP处理方法

5.2.2 乙烯释放量的测定

5.2.3 果实硬度的测定

5.2.4 ABA含量的测定

5.2.5 ACS活性测定

5.2.6 ACO活性测定

5.2.7 PME活性测定

5.2.8 PG活性测定

5.2.9 纤维素酶活性测定

5.3 结果与分析

5.3.1 激素处理对番茄果实乙烯与ABA含量变化的影响

5.3.2 激素处理对番茄果实乙烯关键酶活性的影响

5.3.3 激素处理对番茄果实硬度及软化关键酶活性的影响

5.4 讨论

5.5 本章小结

第六章 激素处理对番茄果实成熟相关基因表达的影响

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.2.1引物的设计与合成

6.3 结果与分析

6.3.1目的基因片段的PCR扩增

6.3.2 乙烯合成关键基因的研究

6.3.3 软化相关基因的表达研究

6.3.4 ABA合成代谢关键基因表达研究

6.4 讨论

6.5本章小结

第七章 全文结论及展望

7.1 结论

7.2 展望

参考文献

附录

发表论文和参加科研情况说明

致谢