多重靶向性POSS基星型梳状聚合物的制备与表征

摘要

基因治疗在临床应用中遇到了相对严重的瓶颈，即缺乏安全有效的基因传递系统。为了解决这一问题，设计了一种低毒高效的基因转染系统，用于转染内皮细胞，以期提高目的基因的递送效率，从而促进内皮细胞的增殖与迁移。 1.八氨基笼型倍半硅氧烷POSS-NH3+Cl-在碱性条件下与2-溴异丁基酰溴反应，得到大分子引发剂POSS-(Br)8，然后通过原子转移自由基聚合（ATRP）依次引发甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯（DMAEMA）和聚乙二醇单甲基丙烯酸酯（PEGMA）的聚合，以制备具有生物相容性的POSS核心的八臂星型梳状结构的共聚物POSS-PDMAEMA-PPEGMA。梳状PPEGMA的侧链末端被双键化以便于CAGW或CAG-TAT-NLS功能肽的连接，从而合成具有多功能性的星型共聚物。肽功能化的星型共聚物在水中自组装成纳米粒（NPs），并用绿色荧光蛋白融合质粒pEGFP-ZNF580（pDNA）制备NPs/pDNA复合物。经MTT证实，形成的复合物毒性较低。荧光显微镜和流式细胞仪测试结果显示，这些多靶向功能化的基因复合物能有效转染内皮细胞，其转染效率高于阳性对照PEI25kDa。此外，western blot印迹实验、伤口愈合实验和体外血管形成实验也证明复合物可以有效地在内皮细胞中递送和表达pDNA，转染后的细胞具有较高迁移率并且提升了内皮化能力。这些具有梳状结构和POSS核心的星型共聚物是一种具有潜力的基因治疗载体。 2.星型梳状聚合物POSS-PDMAEMA-PPEGMA（POSS-DP）与质粒pDNA复合形成二元基因复合物POSS-DP/pDNA，然后多重靶向性的功能肽TAT-NLS或CAG-TAT-NLS与二元基因复合物混合，以形成三元基因递送系统POSS-DP/pDNA/TAT-NLS与POSS-DP/pDNA/CAG-TAT-NLS。相比较于传统的二元基因递送系统，设计的三元基因递送系统具有相对更高的灵活性，便于负载与释放基因。通过细胞摄取实验和体外荧光转染实验结果证明设计的递送系统有利于细胞摄取以及提升内皮细胞的转染效率。

目录

声明

前言

第1章 文献综述

1.1 基因治疗概况

1.2 非病毒基因载体

1.2.1 线性非病毒基因载体

1.2.2 星型非病毒基因载体

1.3 基因载体的递送过程及障碍解决方法

1.3.1 载体负载基因的方式

1.3.2 体内运输到靶细胞内的过程

1.3.3 细胞摄取过程

1.3.4 内涵体逃逸过程

1.3.5 核转运过程

1.4 本论文研究意义、研究内容及创新点

1.4.1 本论文研究意义

1.4.2 本论文研究内容

1.4.3 本论文创新点

第2章 多肽修饰的POSS基星型梳状聚合物的合成与化学表征

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 实验原料与仪器

2.2.2 星型梳状聚合物POSS-PDMAEMA-PPEGMA的合成

2.2.3 末端双键化的POSS-PDMAEMA-PPEGMA-DAs的合成

2.2.4 多肽修饰的星型梳状聚合物的合成

2.2.5 纳米粒NPs以及NPs/pDNA复合物的制备

2.2.6 纳米粒NPs以及NPs/pDNA复合物的物理与化学表征

2.3 结果与讨论

2.3.1 多肽修饰的POSS基星型梳状聚合物的合成

2.3.2 1H NMR测试

2.3.3 GPC测试

2.3.4 功能性多肽的含量测定

2.3.5 纳米粒NPs和NPs/pDNA复合物的粒径和zeta电位

2.4 本章小结

第3章 多肽修饰的POSS基纳米粒NPs作为基因载体促进内皮细胞的增殖与迁移

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验原料与仪器

3.2.2 纳米粒NPs以及NPs/pDNA复合物的制备

3.2.3 纳米粒NPs以及NPs/pDNA复合物的生物表征

3.3 结果与讨论

3.3.1 凝胶电泳实验

3.3.2 纳米粒NPs以及NPs/pDNA复合物的MTT毒性实验

3.3.3 体外荧光转染实验

3.3.4 划痕实验

3.3.5 体外血管形成实验

3.3.6Western blot分析

3.3.7 NPs/Cy5-寡核苷酸复合物的细胞摄取

3.4 本章小结

第4章 POSS基聚合物与功能性多肽以及基因三元基因递送系统的制备与表征

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 实验原料与仪器

4.2.2 三元基因递送系统的制备

4.2.3 流体力学粒径与电位

4.2.4 琼脂糖凝胶电泳实验

4.2.5 体外细胞转染

4.2.6 细胞摄取

4.3 结果与讨论

4.3.1 流体力学粒径与电位

4.3.2 凝胶电泳结果

4.3.3 体外细胞转染

4.3.4 细胞摄取

4.4 本章小结

第5章 结论

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

致谢