深黄被孢霉发酵生产γ-亚麻酸及其分子遗传学的研究

摘要

该文利用脉冲凝胶电泳(CHEF)系统首次确定了被孢霉属中产GLA的深黄被孢霉AS3.3410(Mortierellaisabellina AS3.3410)及其诱变株M<,6-22)、MH<,23>以及不产GLA的拉曼被孢霉AS3.3413(Mortierella ramanniana AS3.3413)和葡酒色被孢霉AS3.3414(Mortierellavinacea AS3.3414)的染色体数目及基因组大小.该文在研究深黄被孢霉基因组结构的基础上,进一步对γ-亚麻酸代谢过程中的关键酶——△<'6>-脂肪酸脱氢酶在基因水平上进行了研究.△<'6>-脂肪酸脱氢酶是以亚油酸(C18:2△<'9,12>为底物,在C<,6>和C<,7>位之间脱氢 形成γ-亚麻酸(C18:3△<'6,9,12>),克隆到该基因对提高GLA产量,进行基因工程菌的构 建和转基因植物具有重大意义,该论文将已发表的高等植物、动物、蓝细菌、真菌的△<'6>-脂肪酸脱氢酶序列进行同源性比较,发现△<'6>-脂肪酸脱氢酶具有三个组氨酸保守区,但与其它位点的脂肪酸脱氢酶不同的是,△<'6>-脂肪酸脱氢酶在N端特有细胞色素b<,5>(Cytb<,5>)区,因此,研究人员根据Cytb<,5>区的HPGG和组氨酸保守区ⅢQIEHHLFP的氨基酸序列 设计引物,提取深黄被孢霉的总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增出的DNA片段进行连接、转化、最后对重组质粒进行酶切鉴定和测序.该论文在研究深黄被孢霉生产GLA的发酵工艺基础 上,对该菌株进行了电泳型分析,首次报道了其染色体数目和基因组大小,并以产γ-亚麻 酸的关键酶——△<'6>-脂肪酸脱氢酶基因进行了克隆和序列分析,为更深入细致地研究被 孢霉中脂肪脱氢酶系统的分子遗传学,揭示产生GLA的调控机制打下了坚实的基础.

目录

文摘

英文文摘

第一章γ—亚麻酸中试发酵的研究

一、前言

(一)γ—亚麻酸的发现历史及代谢路线

(二)γ—亚麻酸及其代谢产物的生理功能

(三)微生物发酵生产γ—亚麻酸的研究进展

二、实验材料和方法

(一)实验材料

(二)实验方法

三、实验结果

(一)原生质体的获得

(二)紫外线对原生质体的影响

(三)高产γ—亚麻酸诱变菌株的获得

(四)遗传稳定性实验

(五)500立升罐发酵结果

(六)2.5吨罐发酵结果

(七)油脂的提取

(八)γ—亚麻酸的浓缩

四、讨论

参考文献

第二章深黄被孢霉的电泳核型分析

一、前言

(一)脉冲电泳的原理

(二)脉冲电泳的发展过程

(三)脉冲电泳在丝状真菌中的应用

(四)选题的意义

二、实验材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

三、实验结果

(一)原生质体的制备

(二)深黄被孢霉AS3.3410的电泳核型分析

(三)深黄被孢霉AS3.3410诱变株M6-22，MH23及拉曼被孢霉、葡酒色被孢霉的电泳核型分析

四、讨论

参考文献

第三章深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和测序

一、前言

(一)脂肪酸脱氢酶的研究进展

(二)几种主要脂肪酸脱氢酶的比较及结构分析

(三)选题——深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆

二、实验材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

三、实验结果

(一)△6-脂肪酸脱氢酶mRNA丰度与菌体培养时间的关系

(二)深黄被孢霉总RNA的提取及质量的检测

(三)深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶保守区cDNA的克隆和测序

(四)深黄被孢霉M6-22△ 6-脂肪酸脱氢酶结构基因的克隆和序列分析

四、讨论

参考文献

总结

攻读博士学位期间发表的相关著作及论文

致谢