乙型肝炎病毒X蛋白对肝癌细胞周期的作用及其作用途径的研究

摘要

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)与肝癌的发生发展密切相关,在由HBV导致的肝癌的发生发展过程中,乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)具有重要的作用.肝癌细胞同其它种类的癌细胞的一个共同的特征是细胞周期调控的紊乱.因此,阐明HBx对细胞周期调控的作用及其作用途径具有重要的意义.该文就此做了初步的探讨.将不同剂量的克隆有HBx基因的真核表达载体pCMV-X瞬时转染至H7402肝癌细胞中,经流式细胞仪检测后发现,与对照组细胞相比,G<,1>/G<,0>期的细胞数目增加,并且随着HBx剂量的增加,凋亡细胞的数目明显增多,表明HBx蛋白能够在G<,1>/G<,0>期阻断细胞周期并具诱导细胞凋亡的作用.通过Western blot检测发现,随着HBx蛋白表达水平的增加,p27的表达水平呈上升趋势,而细胞周期蛋白Cyclin E和Cyclin D的表达水平呈下调趋势.然而,应用稳定转染HBx基因的肝癌细胞株X-H7402研究的结果显示,与对照组相比,p27的表达呈下降趋势,而Cyclin E和Cyclin D的表达水平呈上调趋势.HBXIP(hepatitis B X interacting protein,HBXIP)蛋白是近几年来发现的HBx结合蛋白,目前国内外对HBXIP蛋白的研究很少,为了探讨HBXIP与HBx蛋白对细胞周期调控的影响,我们将HBXIP基因进行了分子克隆.根据Genbank中报道的HBXIP基因全长mRNA序列设计PCR产物,以从胎儿心肌组织中提取的总RNA为模板进行RT-PCR,成功地将PCR产物克隆到真核表达载体pcDNA3-myc中,将其命名为pcDNA3-xip,经测序证实无突变.然后,进行瞬时基因转染实验,用流式细胞仪检测后发现,用pCMV-X质粒转染后,细胞凋亡率为29.2﹪;采用pcDNA3-xip和pCMV-X质粒共转染后,细胞凋亡率为13.3﹪,表明HBXIP能明显地抑制由HBx引起的细胞凋亡.同时,应用Western blot检测发现,在pcDNA3-xip和pCMV-X质粒共转染后,与转染pCMV-X质粒组相比,p27的表达水平出现下调,而cyclin E和Cyclin D的表达水平基本没有变化.综上所述,该研究发现HBx可以通过调控细胞周期相关因子p27、cyclin E和cyclin D的表达水平来影响肝癌细胞周期的进行,并导致细胞凋亡.同时发现,HBXIP蛋白具有抑制HBx的凋亡诱导作用.该研究结果有助于进一步阐明乙肝病毒的致癌机理,从细胞周期方面提供了新的实验依据.

目录

文摘

英文文摘

缩写词表

前言

1.乙型肝炎病毒

2.细胞周期

3.HBx蛋白与细胞周期的关系

4.细胞凋亡

实验目的和意义

第一部分HBx蛋白对肝癌细胞周期的作用及对细胞周期相关蛋白表达的影响

1.实验材料及试剂

2.实验方法

2.1不同剂量HBx基因的瞬时转染

2.2流式细胞仪分析细胞周期

2.3Western blot检测

3.结果

3.1质粒的瞬时转染

3.2细胞形态学观察

3.3流式细胞仪检测细胞周期

3.4Western blot

第二部分HBXIP表达载体的构建

1.实验材料及试剂

2.实验方法

2.1外源片断的获得

2.2载体片断的获得

2.3 PCR产物与载体DNA的连接

2.4DNA连接产物的转化

2.5重组子的筛选及鉴定

3.结果

第三部分HBx和HBXIP对肝癌细胞周期及细胞周期相关因子表达的影响

1.实验材料及试剂

2.实验方法

2.1 pCMV-X及pcDNA3-xip质粒的共转染

2.2流式细胞仪检测

2.3Western blot检测

3.结果

3.1 pCMV-X及pcDNA3-xip质粒的共转染

3.2流式细胞仪检测

3.3 Western blot

讨论

小结

参考文献

附录1 溶液的配制

致谢