甘油氧化酶生产菌株的选育及甘油氧化酶酶学性质的研究

摘要

甘油氧化酶(GlycerolOxidase，GLOX)在氧气存在的情况下，可将甘油氧化为甘油醛，同时产生过氧化氢。甘油氧化酶可以替代甘油激酶和甘油磷酸氧化酶对血液中甘油三脂进行测定。甘油氧化酶还可将乙二醇经由羟乙醛氧化为乙二醛，可将乙醇酸氧化为乙醛酸。因为酶催化反应的速度快，无副产品产生，如将其用于工业生产乙二醛和乙醛酸，具有广泛的应用前景。 本研究从一株产甘油氧化酶的日本曲霉(AspergillusjaponicusSaito)As8586出发，首先对其发酵条件进行了一系列的研究，然后分别通过紫外线和亚硝基胍诱变，获得一株相对稳定高产的诱变菌株Aj100015，其酶活力达到2.1U/ml；最后设计单因子实验和正交实验对原始培养基进行了优化，结果在含4％甘油，0.4％酵母浸膏，0.13％K2HPO4，0.05％KCl，0.1％MgSO4，0.018％FeSO4，0.1％玉米浆，初始pH为6.2的培养基中，于30℃，200转/分的转速下，培养48小时，产生的甘油氧化酶活力最高，达到4.1U/ml。 通过收集菌体，高压破碎，硫铵盐析，SephadexG-25凝胶过滤，QSepharoseHP离子交换，SephacrylS-300凝胶过滤层析对甘油氧化酶蛋白进行了分离纯化，并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确定其分子量为416KD，经SDS-PAGE确定其由八个分子量约为52.3KD的亚基组成。等电聚焦电泳测得其等电点为4.9。 甘油氧化酶在以甘油为底物时，最适作用温度为37℃，最适pH为5.0，其Km值为8.4mmol/L，Vmax为12.3×10-3mmol/L·min-1。甘油氧化酶在pH9.5的碱性条件下较为稳定，金属离子Cu2+、Ca2+和Zn2+对酶活有一定的激活作用，Hg2+则有明显的抑制作用。

目录

文摘

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第一章前言

1.1甘油氧化酶的定义

1.2研究甘油氧化酶的意义

1.3甘油氧化酶的理化性质

1.4甘油氧化酶的生产菌株

1.5选题依据和研究路线

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1实验菌株

2.1.2培养基

2.1.5试剂

2.1.6仪器与设备

2.2实验方法

2.2.1菌种选育

2.2.2培养基的优化

2.2.3甘油氧化酶的分离纯化

2.2.4甘油氧化酶的分析与鉴定

2.2.5甘油氧化酶酶学性质的检测

第三章结果与讨论

3.1基本发酵条件的研究

3.1.1菌种的选择

3.1.2 As8586生长曲线的测定及发酵时间的选择

3.1.3通气量对发酵的影响

3.1.4发酵温度的选择

3.2菌体破壁方法的研究

3.2.1 French高压细胞破碎仪破壁效果的观察

3.2.2不同破壁方法的效果比较

3.3紫外线诱变育种

3.3.1紫外线照射剂量的选择

3.3.2紫外线—氯化锂复合诱变及正变菌株的筛选

3.4亚硝基胍诱变育种

3.4.1诱变后的致死率及致死曲线

3.4.2诱变的正变率

3.4.3复筛正变菌株

3.5培养基的优化

3.5.1单因素的优化

3.5.2正交实验

3.6甘油氧化酶保存条件的考察

3.6.1缓冲液的选择——7种缓冲液对甘油氧化酶稳定性的影响：

3.6.2硼砂—碳酸钠缓冲液中添加剂(稳定剂)的选择

3.7甘油氧化酶的纯化

3.7.1硫铵分级沉淀

3.7.2脱盐

3.7.3 Q sepharose HP离子交换层析

3.7.4 Sephacryl S-300凝胶过滤层析

3.7.5纯酶冻干粉的制备

3.8甘油氧化酶的理化性质

3.8.1非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)

3.8.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶变性电泳

3.8.3甘油氧化酶等电点测定：

3.9甘油氧化酶酶学性质的研究

3.9.1甘油氧化酶反应的最适温度和温度的耐受性：

3.9.2甘油氧化酶的最适pH和pH耐受性的检测

3.9.3甘油氧化酶的Km值和Vmax的测定：

3.9.4甘油氧化酶的底物特异性

3.9.5金属离子对酶活力的影响

小 结

参考文献

致 谢