DNA特殊拓扑异构体和E.coli拓扑异构酶Ⅲ的研究

摘要

在生理状态下,质粒DNA存在各种特殊的拓扑结构。细胞内拓扑异构体的产生与各种生命活动(尤其是DNA复制和RNA转录)相关。相应的DNA拓扑结构具有重要的生物学意义,参与DNA的复制、包装、RNA的转录以及基因的表达调控。在本实验中我们发现,在含有质粒pBR322的大肠杆菌HB101中,在对数期加入抗生素后,产生了三条高迁移率的特殊电泳条带。原子力显微镜和透射电子显微镜观察显示,三种结构与正常的超螺旋分子有着明显的区别,呈现出不同形态的打结结构,具有较高的压缩比,可能是细胞自我保护产生的。 对碱变性结构的研究发现：碱变性结构的变性局限在非常狭窄的范围内。碱变性结构对限制性内切酶具有相当强的抗性,对拓扑异构酶Ⅰ也不敏感,但旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ可以作用于碱变性分子。原子力显微镜观察其结构,碱变性结构比普通超螺旋分子在轴向上缩短,而分子的直径加长。经拓扑异构酶Ⅳ处理后,电泳迁移率发生改变,分子内出现数量不等的打结结构。碱变性结构的详细结构特征还需进一步深入研究。 大肠杆菌中的拓扑异构酶Ⅲ和拓扑异构酶Ⅰ同源,属IA型拓扑异构酶。在体内对染色体的正确分离具有重要的意义,且拓扑异构酶Ⅲ可作用于Holliday中间体,使重组复合体得以有效的分离。在本实验中我们发现,拓扑异构酶Ⅰ缺陷的大肠杆菌在进入静止期时,对数期形成的高负超螺旋被松弛。当以高浓度的新生霉素抑制拓扑异构酶Ⅳ和旋转酶的活性后,加入利福平仍能诱发高负超螺旋的松弛。体外的松弛实验表明拓扑异构酶Ⅲ具有松弛高度负超螺旋的能力,且与静止期水平相似。另外在其他菌株中,在相同的培养条件下,质粒均得到不同程度的松弛,而在拓扑异构酶Ⅲ的缺陷菌株中质粒的状态几乎没有变化。我们推测拓扑异构酶Ⅲ在应激状态下(转录终止或饥饿)可被激活并调控体内的超螺旋水平,但其调控机制和效应分子还有待于探索。

目录

文摘

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第一章前言

第一节DNA的拓扑结构和功能

第二节细胞中的DNA拓扑异构酶

1.2.1 DNA拓扑异构酶的分型

1.2.2大肠杆菌细胞中的主要拓扑异构酶

第三节质粒拓扑结构的研究现状

第四节拓扑异构酶Ⅲ的研究现状

第六节研究意义

1.6.1 DNA拓扑结构的研究目的和意义

1.6.2拓扑异构酶Ⅲ的研究意义

第二章材料与方法

第一节实验材料

2.1.1实验所用的菌株和质粒

2.1.2试剂

2.1.3仪器及设备

第二节实验方法

2.2.1质粒DNA对细胞的转化

2.2.2细菌培养

2.2.3质粒的小量制备

2.2.4质粒的大量制备

2.2.5碱变性结构的制备

2.2.6质粒DNA的氯喹-琼脂糖凝胶电泳

2.2.7原子力显微镜

2.2.8透射电子显微术

2.2.9拓扑异构酶Ⅲ的表达纯化

2.2.10体外酶活鉴定：

第三章结果与讨论

第一节质粒特殊拓扑异构体的研究

3.1.1几种抗生素对大肠杆菌HB101中pBR322 DNA拓扑结构的影响

3.1.2 pBR322 DNA的特殊结构成分Ⅰ的投射电镜研究

3.1.3 pBR322 DNA的特殊结构成分Ⅱ，Ⅲ的原子力显微镜研究

第二节质粒pBR322碱变性结构的研究

3.2.1质粒pBR322的碱变性及碱变性超螺旋DNA的纯化

3.2.2碱变性结构的内切酶处理

3.2.3碱变性结构(formⅣDNA)的拓扑异构酶处理

3.2.4讨论

第三节拓扑异构酶Ⅲ对质粒拓扑结构的影响

3.3.1拓扑异构酶Ⅲ的体外表达纯化

3.3.2在E.coli DM800中，抑制拓扑异构酶Ⅳ和gyrase对DNA拓扑结构的影响

3.3.3高负超螺旋质粒的拓扑异构酶处理

3.3.4在其他菌株中抑制旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ的活性对拓扑结构的影响

3.3.5讨论

第四章结论

致谢

参考文献

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