胆汁中K-ras、p53基因突变检测对胆管癌与胆管良性狭窄鉴别诊断价值的研究

摘要

背景: 胆管癌是危害人类健康的胆道疾病,恶性程度高,早期诊断率低,预后极差。特别对于那些不典型的病例,与胆管良性狭窄鉴别诊断困难,可能并不能做出明确的定性诊断,进而对治疗方案的选择产生影响.因此如何鉴别胆管癌与胆管良性狭窄对尽早选择方案,早期治疗及延长病人生存期具有重大意义。 随着分子生物学技术的发展,对胆管癌的发生发展和生物学行为的研究已进入基因水平。因此,对胆汁中的肿瘤相关基因进行分析为胆管癌的特异性诊断提供了可能。与胆管癌相关的基因中,以癌基因K-ras和抑癌基因p53的研究最广泛深入.目前,对于胆道恶性肿瘤患者胆汁中K-ras基因或p53基因突变情况的研究并不太多,且效果具有一定局限性。因此联合检测胆管癌患者胆汁上清液及沉淀中K-ras基因和p53基因突变情况可以完善胆管癌的分子生物学研究。同时对比胆管良性狭窄来评估基因分析的临床有效性。 目的: 探讨联合检测胆汁离心后上清液和沉淀物中K-ras基因和p53基因突变对胆管癌诊断的敏感性及特异性,对胆管癌及胆管良性狭窄鉴别诊断的价值。以及上清液和沉淀物中基因突变检测结果是否有所不同。 方法: 1.收集天津市第一中心医院、天津市南开医院、解放军二五四医院等医院的胆汁标本30例,其中正常胆汁10例,胆管良性狭窄患者胆汁10例,胆管癌患者胆汁10例。将胆汁样品离心后分别对上清和沉淀立即进行DNA提取。 2.采用PCR方法分别进行目的基因K-ras和p53的扩增。SSCP银染色分析检测基因突变。对异常泳动条带进行DNA测序。 结果: 1、正常胆汁样品的上清及沉淀中均未检测到基因突变。 2、胆管良性狭窄患者胆汁样品的上清及沉淀中均未检测到基因突变。 3、胆管癌患者胆汁样品中,上清中检测到p53及K-ras基因突变率分别为40.0％(4/10)和40.0％(4/10),沉淀中检测到p53及K-ras基因突变率分别为20.0％(2/10)和30.0％(3/10)。联合检测上清及沉淀中p53及K-ras基因突变率上升为60％。 结论: 1、正常胆汁及胆管良性狭窄患者胆汁样品中均未检测到基因突变。 2、胆管癌胆汁上清液的K-ras基因p53基因突变率要高于沉淀的突变率。 3、联合检测胆管癌的胆汁上清液及沉淀中K-ras基因与p53基因突变率可加强胆管癌的基因诊断。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:主要缩略词中英文对照表

声明

第一章引言

第二章实验材料和方法

第一节实验原理

2.1.1 PCR(聚合酶链反应)原理

2.1.2 PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性分析)原理

第二节实验材料

第三节方法步骤

2.3.1胆汁标本DNA提取

2.3.2 DNA琼脂糖凝胶电泳

2.3.3 K-ras外显子、p53外显子的PCR扩增

2.3.4 SSCP银染

2.3.5 DNA测序

2.3.6统计学分析

第三章实验结果

第一节DNA的提取

第二节K-ras基因及p53基因外显子序列片段PCR扩增产物

第三节SSCP银染分析

第四节DNA测序

第五节统计

第四章讨论

第一节PCR-SSCP分析要点

4.1.1 PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)分析要点

4.1.2 SSCP(single strand conformation polymorphism，单链构象多态性)分析要点

4.1.3实验结果的讨论

第二节胆管癌与K-ras基因和p53基因

第三节前景与展望

第五章小结

参考文献

致谢

个人简历

综述 K-ras基因、p53基因与胆管癌