基于pH敏感和还原性敏感智能纳米药物载体研究

摘要

多肽蛋白类药物的口服给药能否实现关键在于，保护药物不受胃液中酸性物质(pH l.4)和各种酶的破坏，顺利进入肠道后通过跨膜转运到细胞内部或者进入血液循环系统进而起到相应的治疗作用。将其包裹在纳米微胶囊中保护其不被破坏并能随环境智能响应释放从而为实现蛋白口服给药提供了可能性。层层自组装聚电解质中空纳米微胶囊以其可控的尺寸、结构及通透性在蛋白药物传递领域中有着潜在的应用价值。
　　 本文首先采用层层自组装技术将水溶性壳聚糖和硫酸葡聚糖通过静电作用组装在氨基化的SiO2硅球表面，随后除去硅核制备纳米微胶囊，试图解决三个方面的问题：(1)常用的药物载体负载药物包封率较低；(2)混合负载或者扩散吸附负载容易造成突释；(3)微米级微胶囊除去核之后容易塌陷。
　　 针对以上存在的问题，首先利用蛋白类药物的带电性通过静电吸引作用载药以提高其包封率，然后将水溶性壳聚糖和硫酸葡聚糖通过层层自组装技术把药物包裹在纳米微胶囊内部以降低释放时药物突释的可能性。将硅核制备成纳米级别，除去硅核后得到的纳米微胶囊以图能保持球型结构。首先了制备纳米级别单分散的氨基功能化硅球芯材，通过控制溶液的pH值静电吸附负载药物模型牛血清白蛋白(BSA)，采用层层自组装技术将具有相反电荷生物可降解的水溶性壳聚糖和硫酸葡聚糖包裹在载药硅球外表面，制备了核壳结构的纳米球，除去硅核得到稳定的纳米微胶囊。通过动态光散射仪测定显示：氨基功能化硅球呈现单分散，粒径约为120nm左右，组装后粒径明显增大；Zeta电势(ζ)测定显示：每次聚电解质沉积后，电势反转，呈现良好的交替性：SEM和TEM形貌观察显示：氨基功能化硅球表面光滑，组装后表面变得粗糙，能看到明显的核壳结构，除去硅核后呈现中空结构，并能保持球形结构；FTIR显示硅核已经完全除尽；包封率测定结果显示：静电吸附作用载药包封率比单纯的氢键吸附包封率较高；激光共聚焦观察显示：FITC标记的BSA包裹在微胶囊内部而不是周围；体外释放模拟结果：在最初的2h内没有明显的突释，说明微胶囊能很好的控制突释，在pH l.4时释放很少，而在pH7.4时缓慢释放，微胶囊具有明显的pH响应性，并且研究了组装层数，最外层囊材等对释放的影响，利用释放通用模型对释放数据进行了回归，初步评价了微胶囊的释放机理；细胞毒性实验显示：微胶囊具有较好的生物相容性；圆二色谱实验显示：水溶性壳聚糖相比大分子量壳聚糖（非水溶性）来说，近中性环境有利于避免蛋白药物变性。
　　 本论文进一步采用不同巯基化含量的壳聚糖和硫酸葡聚糖作为囊材组装微胶囊，交联后出去硅核得到巯基交联密度由内到外逐渐增大的梯度交联微胶囊，试图解决三个方面的问题：(1)增加微胶囊的稳定性；(2)保护蛋白类药物在交联时不至于晶型错位；(3)微胶囊具有还原性敏感，跨膜转运到细胞内并在还原型谷胱甘肽的作用下释放药物。
　　 针对以上问题，本部分设计了以不同巯基化接枝度的巯基化壳聚糖作聚阳离子基，以硫酸葡聚糖做聚阴离子基，采用层层自组装技术将其组装在β-环糊精改性的氨基功能化硅球表面，得到纳米级的核壳微球，采用弱氧化剂氯胺-T使巯基交联后，除去硅核得到梯度交联的微胶囊。通过1HNMR和FTIR表征了巯基化壳聚糖和β-环糊精改性的氨基硅球；SEM和TEM形貌观察显示：交联前后具有不同的表面特征，除去硅核后有明显的中空结构；Ellmaa方法和XPS方法测定氧化交联前后的巯基含量结果：交联后的巯基基本上全部被氧化成二硫键；体外释放实验显示：微胶囊具有明显的还原敏感性和pH响应性，不同的谷胱甘肽浓度对药物释放产生影响，低谷胱甘肽浓度还原下的药物释放量较少，不同的pH环境释放速度也不同；细胞吸收实验显示：载有FITC标记的BSA微胶囊能进入到细胞内部，并在细胞内谷胱甘肽的作用下还原释放出药物；圆二色谱实验显示;β-环糊精疏水空腔能保护蛋白药物变性，且梯度交联具有明显的优势；采用Ritger-Peppas模型对数据进行回归分析，得到释药机制是扩散和聚合物裂解的共同作用结果。微胶囊降解实验表明：微胶囊具有较好的降解性，且酸性环境降解比在近中性环境中更快。
　　 上述结果显示，纳米微胶囊的潜在应用价值将在多肽蛋白类药物口服给药系统研究中发挥越来越大的作用。