人工培育蛹虫草中有效成分的提取及抗肿瘤作用的研究

摘要

蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草、蛹草菌等，是由子座与菌核两部分组成的复合体。蛹虫草为虫草属的模式种，其分布非常广泛，含有的化学成分与冬虫夏草相似，包括虫草素、虫草多糖、麦角甾醇等，具有较高的经济价值和医疗保健作用，已经为世界各国学者所认识和接受。目前有一些研究报道了蛹虫草的抗肿瘤作用，如蛹虫草粉、水提物或醇提物等，但并没有从开发的角度进行系统的抗肿瘤作用的研究。
　　 考虑到天然冬虫夏草的资源匮乏，蛹虫草的药用价值及作为冬虫夏草的替代品的潜在性，本研究先用全蛹虫草粉经口给药的方式对接种有S180(肉瘤180)、HepA(肝癌腹水)、U14(宫颈癌14)、EAC(艾氏腹水癌)四种动物肿瘤的昆明种小白鼠进行抗肿瘤实验，结果发现蛹虫草粉对EAC实体瘤及HepA实体瘤显示出一定的活性，特别是对肝癌HepA肿瘤生长抑制率接近30％且有统计学意义。
　　 为了进一步提高抗肿瘤作用，获得更好的抗肿瘤效果，本研究采用水回流提取、水超声提取、75％乙醇回流提取、75％乙醇超声提取四种方法提取蛹虫草中的有效成分，提取物用高效液相色谱测有效成分虫草素和腺苷的含量，实验结果说明75％乙醇回流提取获得的虫草素和腺苷的含量最高。同时，用MTT法测四种提取液对Hek293细胞以及四种肿瘤细胞-乳腺癌细胞(MCF-7)、人结肠癌细胞(LoVo)、肝癌细胞(HepG2)、胶质瘤细胞(U251)的体外肿瘤细胞抑制率，结果发现提取物对四种肿瘤细胞均有一定的抑制作用，提取物对乳腺癌细胞的总体抑制率要高于结肠癌细胞、肝癌细胞和胶质瘤细胞，且回流提取物对肿瘤细胞的细胞毒作用最大。
　　 从乙醇的浓度和提取时间对回流提取进行优化，同时对蛹虫草和天然冬虫夏草采用优化后的条件用同一提取方法进行提取，发现提取物的量以及腺苷和虫草素的含量，蛹虫草均高于天然冬虫夏草。体外抗肿瘤实验显示，作用48 h和72 h后，蛹虫草提取物对乳腺癌细胞的抑制率要高于冬虫夏草。
　　 为了进一步了解人工培育的蛹虫草提取物对肿瘤细胞的影响，通过流式细胞仪检测细胞周期，结果表明提取物作用12 h、24 h、36 h、48 h时细胞被阻止在S期，且在提取物作用36 h时检测到细胞凋亡。这为人工培育蛹虫草的市场开发，替代冬虫夏草及蛹虫草的抗肿瘤作用研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 引言

第一节 蛹虫草

1.1.1 蛹虫草概述

1.1.2 蛹虫草主要化学成分

1.1.3 蛹虫草的药理学研究

1.1.4 蛹虫草的人工培育现状

第二节 细胞凋亡

1.2.1 细胞凋亡概述

1.2.2 细胞凋亡的形态特征

1.2.3 细胞凋亡的生化特征

1.2.4 细胞凋亡机制

第三节 肿瘤与细胞凋亡

1.3.1 肿瘤的危害及抗肿瘤的重要性

1.3.2 细胞凋亡与肿瘤

1.3.3 细胞凋亡与肿瘤治疗

第四节 实验方案设计

第二章 全蛹虫草粉对肿瘤的生长抑制作用

第一节 实验材料

2.1.1 仪器

2.1.2 实验动物

2.1.3 动物肿瘤

2.1.4 药品与试剂

第二节 实验方法

2.2.1 动物模型的建立

2.2.2 抗肿瘤治疗实验方案

2.2.3 治疗效果评价

2.2.4 数据处理

第三节 实验结果

2.3.1 蛹虫草粉对小鼠肿瘤肉瘤180(S180)的生长抑制作用

2.3.2 蛹虫草粉对小鼠肿瘤宫颈癌(U14)的生长抑制作用

2.3.3 蛹虫草粉对小鼠肿瘤艾氏腹水癌(EAC)的生长抑制作用

2.3.4 蛹虫草粉对小鼠肿瘤肝癌(Hep A)的生长抑制作用

第四节 讨论

第三章 蛹虫草中有效成分的提取及含量的测定

第一节 实验材料

3.1.1 实验仪器

3.1.2 实验试剂

3.1.3 溶液的配制

第二节 实验方法

3.2.1 四种不同的提取方法提取蛹虫草中的有效成分

3.2.2 蛹虫草提取液中虫草素和腺苷含量的测定

第三节 实验结果

3.3.1 虫草素标准曲线的绘制

3.3.2 腺苷标准曲线的绘制

3.3.3 四种不同方法提取物中虫草素和腺苷的含量

第四节 讨论

第四章 四种提取方法的提取物对肿瘤细胞的抑制作用

第一节 实验材料

4.1.1 材料和仪器

4.1.2 试剂

4.1.3 试剂的配制

第二节 实验方法

4.2.1 实验用哺乳动物细胞的贴壁培养

4.2.2 哺乳动物细胞冻存

4.2.3 哺乳动物细胞的复苏

4.2.4 提取物溶液的配制

4.2.5 MTT法测药物对正常细胞及四种肿瘤细胞的抑制作用

第三节 实验结果

4.3.1 四种方法的提取物对正常细胞Hek293的影响

4.3.2 四种方法的提取物对乳腺癌细胞(MCF-7)的影响

4.3.3 四种方法的提取物对人结肠癌细胞(LoVo)的影响

4.3.4 四种方法的提取物对胶质瘤细胞(U251)的影响

4.3.5 四种方法的提取物对肝癌细胞(HepG2)的影响

4.3.6 提取物对肿瘤细胞的IC50及抑制率比较

第四节 讨论

第五章 提取方法的优化及蛹虫草与天然冬虫夏草的比较

第一节 实验材料和仪器

5.1.1 实验材料

5.1.2 实验仪器

第二节 实验方法

5.2.1 标准品溶液的配制

5.2.2 不同乙醇浓度对提取的影响

5.2.3 时间对提取的影响

5.2.4 蛹虫草和冬虫夏草有效成分的提取

5.2.5 样品的制备

5.2.6 蛹虫草和冬虫夏草中虫草素和腺苷含量的比较

5.2.7 蛹虫草和冬虫夏草提取物质谱比较

5.2.8 蛹虫草和冬虫夏草提取物对MCF-7细胞的作用

第三节 实验结果

5.3.1 不同乙醇浓度对提取的影响

5.3.2 不同时间对提取的影响

5.3.3 蛹虫草和冬虫夏草提取物中虫草素和腺苷含量的比较

5.3.4 蛹虫草和冬虫夏草提取物对乳腺癌(MCF-7)细胞的作用

5.3.5 蛹虫草和冬虫夏草提取物的质谱鉴定

第四节 讨论

第六章 提取物对细胞周期和细胞凋亡的作用

第一节 实验材料与试剂

6.1.1 实验材料

6.1.2 试剂

6.1.3 试剂配制

第二节 实验方法

6.2.1 蛹虫草提取液的制备

6.2.2 提取液对肿瘤细胞周期的影响

6.2.3 蛹虫草提取液对肿瘤细胞凋亡的作用

第三节 实验结果

6.3.1 蛹虫草提取物对乳腺癌(MCF-7)细胞周期的影响

6.3.2 荧光显微镜观察凋亡细胞与死亡细胞

6.3.3 蛹虫草提取物对乳腺癌(MCF-7)细胞凋亡的影响

第四节 讨论

第七章 结论

参考文献

致谢

个人简历