产紫杉醇真菌NK-101关键基因的功能研究与营养缺陷型菌株的构建

摘要

紫杉醇类化合物具有三环二萜的骨架结构，最初是从红豆杉等植物中分离获得。研究发现，紫杉醇是一种高效、低毒、应用广谱、作用机制独特的天然抗肿瘤药物。但是由于受到原料来源和提取技术的制约，长期以来紫杉醇类药物在市场上处于供不应求的状态。近年来，应用植物内生真菌发酵大规模生产紫杉醇的技术取得了一定进展，为提高紫杉醇的产量开辟了新的途径，将会带来巨大的市场前景和经济效益。
　　 近二十年来，拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis genus)真菌由于能产生大量的具有生物活性的天然产物，越来越引起人们的关注。但是目前的许多研究报道还只停留在宏观的水平，对其深入的分子层面的研究还很少。本实验室筛选到一株产紫杉醇的拟盘多毛孢属真菌NK-101，经过形态学和分子生物学上的分析鉴定，认为NK-101属于Pestalotiopsis malicola。目前本实验室已经对NK-101进行de novo全基因组测序，首次获得拟盘多毛孢属真菌的基因组信息，为全面研究NK-101菌株中关键基因功能奠定了基础。
　　 本实验通过氨基酸序列比对，得到了NK-101菌株中与加拿大红豆杉（Taxuscanadensis）中苯丙氨酸氨基变位酶（phenylalanine aminomutase）(GenB ank:AAT47186.1)和美国短叶红豆杉（Taxus brevifolia）中紫杉二烯合成酶(taxadienesynthase)(GenBank: U48796)同源性较高的基因，将其分别命名为PAM基因和TS基因;通过农杆菌介导的丝状真菌转化的方法，将敲除质粒转入NK-101菌株中并将PAM基因和TS基因定向敲除，获得△pam和△ts菌株。通过对比野生型NK-101菌株和敲除菌株的菌落形态、产孢能力、菌丝生物量以及次级代谢产物合成能力等多种指标，推测PAM基因和TS基因的功能并做进一步的研究。
　　 同时，将NK-101菌株中URA-3基因和ADE基因进行定向敲除，得到了尿嘧啶营养缺陷型菌株和腺嘌呤营养缺陷型菌株，为丝状真菌的转化提供了新的筛选标记。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第一节 紫杉醇类抗癌药物概述

1．1．1 紫杉醇类化合物的研究概况

1．1．2 紫杉醇的结构和性质

1．1．3 紫杉醇的作用机理

1．1．4 几种紫杉醇重要的前体物质

第二节 紫杉醇类药物生产方法的研究概况

1．2．1 从植物中直接提取紫杉醇

1．2．2 紫杉醇的化学合成

1．2．3 植物组织细胞培养

1．2．4 基因工程法

1．2．5 微生物发酵生产紫杉醇

第三节 产紫杉醇真菌的研究

1．3．1 产紫杉醇真菌的研究现状

1．3．2 拟盘多毛包属真菌的研究概况

第四节 紫杉醇合成途径的研究进展

1．4．1 萜类共同前体—异戊烯焦磷酸(IPP)的合成途径

1．4．2 紫杉醇碳环骨架及其侧链的合成

第五节 植物中紫杉二烯合成酶和苯丙氨酸氨基变位酶的研究进展

1．5．1 植物中紫杉二烯合成酶的研究

1．5．2 植物中苯丙氨酸氨基变位酶的研究

第六节 丝状真菌遗传转化技术的研究进展

1．6．1 原生质体转化技术

1．6．2 农杆菌转化技术(ATMT)

第七节 本研究的目的、内容以及意义

1．7．1 研究目的

1．7．2 研究内容

1．7．3 研究意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 质粒

2．1．3 培养基

2．1．4 抗生素

2．1．5 实验试剂

2．1．6 引物

2．1．7 仪器设备

第二节 实验方法

2．2．1 NK-101中PAM和TS基因的定向敲除

2．2．2 NK-101腺嘌呤营养缺陷型敲除载体的构建

2．2．3 NK-101尿嘧啶营养缺陷型敲除载体的构建

第三章 实验结果与分析

第一节 NK-101中PAM和TS基因的定向敲除

3．1．1 通过RT-PCR检测NK-101中PAM和TS基因表达情况

3．1．2 PAM和TS基因定向敲除质粒pB1121-PAM和pB1121-TS的构建

3．1．3 根癌农杆菌LBA4404介导的PAM基因和TS基因的定向敲除

3．1．4 PAM基因敲除菌株和TS基因敲除菌株的Southern blot验证

3．1．5 PAM基因敲除菌株和TS基因敲除菌株的菌落形态变化

3．1．6 PAM和TS基因缺失对NK-101生物量和色素产生的影响

3．1．7 PAM和TS基因缺失对NK-101次级代谢的影响

第二节 NK-101腺嘌呤营养缺陷型敲除载体的构建

3．2．1 ADE基因定向敲除质粒pB1121-ADE的构建

3．2．2 根癌农杆菌LBA4404介导的ADE基因的定向敲除

3．2．3 腺嘌呤营养缺陷型菌株的菌落形态变化

第三节 NK-101尿嘧啶营养缺陷型敲除载体的构建

3．3．1 URA-3基因定向敲除质粒OSCAR-ura3的构建

3．3．2 根癌农杆菌LBA4404介导的URA-3基因的定向敲除

3．3．3 尿嘧啶营养缺陷型菌株的菌落形态变化

第四章 讨论

第一节 Δpam和Δts的进一步探究

第二节 营养缺陷型菌株的获得

小结

参考文献

致谢

个人简历

在学期间发表的学术论文与研究成果