肠道菌群在Con A诱导的肝炎中的作用

摘要

肝脏是体内一个重要的免疫器官，其内含有大量的免疫细胞，如NKT细胞、NK细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、Kupffer细胞和树突状细胞等，这些免疫细胞在维持肝脏免疫功能方面起到重要的作用。而在哺乳动物的肠道中生存着数千种的细菌，这些细菌对机体免疫系统的成熟和维持起着重要的作用。近几十年来，肠道菌群和肝脏免疫系统之间的相互作用受到越来越多的重视，它们之间相互作用的机制也越来越被人们所了解。但是肠道菌群对Con A诱导的急性肝炎的影响仍然不是很清楚。在实验中，我们发现通过灌胃的方式给小鼠使用抗生素可以有效的清除肠道菌群，并且保证小鼠体重不会减轻。在本文的研究中我们发现，用抗生素给小鼠进行两周的处理可以显著降低Con A诱导的急性肝损伤，表现为血清中ALT水平下降，肝脏病理损伤减轻，血清中炎性细胞因子水平降低。而给肠道菌群清除的小鼠进行肠道菌群重组之后则可以提高小鼠对Con A的敏感性，说明肠道菌群在Con A诱导的肝炎中起着重要的作用。然而，Real-TimePCR结果显示，给小鼠注射ConA前后，清除小鼠肠道菌群并没有促进肝脏IL-22和IL-22R的表达，也没有降低肝脏组织中FasL的水平，暗示肠道菌群的清除没有降低肝脏自身对Con A的敏感性，说明肠道菌群清除之后肝炎的减轻不是由肝脏细胞自身对Con A的敏感性改变引起的。进一步的研究表明清除小鼠肠道菌群可以降低肝脏中NKT细胞的比例，增加Treg细胞的比例，并能促进脾脏中Treg细胞的分化，表明肠道菌群可以调控机体免疫系统的构成及功能。给小鼠注射ConA后发现，肠道菌群清除的小鼠的肝脏中NKT细胞比例下降，Treg细胞比例增加，而且血清中的INF-γ和TNF-α水平也显著降低。总之，这些结果表明肠道菌群清除可以降低Con A诱导的肝损伤，可能与NKT细胞和IFN-γ等细胞因子水平的降低，以及Treg细胞的增加有关。因此，选择性的清除特定的肠道菌群可以为肝炎的治疗提供新的思路和方法。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 前言

第一节 肝脏免疫系统综述

第二节 小鼠自身免疫性肝炎

1．2．1 自身免疫性肝炎

1．2．2 Con A诱导的肝炎模型

第三节 肠道菌群的研究进展

1．3．1 肠道共生微生物的组成和功能

1．3．2 肠道共生微生物对机体免疫系统的影响

1．3．3 肠道菌群对疾病的影响

第四节 本课题的研究目的和意义

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 常用试剂

2．1．3 常规耗材

2．1．4 实验仪器

2．1．5 统计分析和作图软件

2．1．6 实验引物序列

第二节 实验方法

2．2．1 小鼠体内实验技术

2．2．2 细胞相关实验技术

2．2．3 Con A诱导的肝炎模型相关技术

2．2．4 肠道菌群清除相关实验技术

2．2．5 其他检测技术

2．2．6 数据统计方法

第三章 实验结果

第一节 小鼠肠道菌群清除模型的建立

3．1．1 自由饮用抗生素清除小鼠肠道菌群

3．1．2 给小鼠灌胃抗生素清除肠道菌群

3．1．3 肠道菌群清除的鉴定

3．1．4 肠道菌群清除后宏观上看与无菌小鼠(Germ Free)类似

第二节 肠道菌群清除后小鼠免疫系统相关描述

3．2．1 免疫器官中CD4+和CD8+T细胞比例的改变

3．2．2 免疫器官中NK与NKT比例的变化

3．2．3 自然调节性T细胞(Treg)的比例

3．2．4 淋巴细胞激活状态分析

第三节 清除小鼠肠道菌群可降低Con A诱导的肝损伤

3．3．1 用抗生素处理1周不能明显降低Con A诱导的肝脏损伤

3．3．2 抗生素处理2周可以明显降低Con A诱导的肝脏损伤

3．3．3 清除肠道菌群可以明显抑制Con A诱导的肝炎中细胞因子的分泌

第四节 肠道菌群重组可提高小鼠对Con A的敏感性

3．4．1 小鼠肠道菌群重组

3．4．2 肠道菌群重组可提高小鼠对Con A敏感性

第五节 肠道菌群清除后免疫细胞功能状态分析

3．5．1 CD4+T细胞分泌IFN-γ的改变

3．5．2 NKT细胞功能分析

3．5．3 CD4+Foxp3+Treg细胞增殖分化的研究

3．5．4 γδ T细胞功能分析

第六节 清除小鼠肠道菌群可降低Con A诱导的肝损伤的原因探索

3．6．1 清除肠道菌群降低Con A诱导的肝损伤与肝细胞自身敏感性无关

3．6．2 Con A诱导的肝炎中，清除肠道菌群后CD4+T细胞功能的研究

3．6．3 Con A诱导的肝炎中，清除肠道菌群后NKT细胞功能的研究

3．6．4 Con A诱导的肝损伤中，清除肠道菌群后γδ T细胞功能的研究

3．6．5 Con A诱导的肝损伤中，清除肠道菌群后Treg细胞功能的研究

第四章 结果讨论与小结

第一节 肠道菌群清除方法的确定

4．1．1 传统肠道菌群清除方法的限制性

4．1．2 灌胃方法可有效清除小鼠肠道菌群

第二节 CD4+T和NKT细胞在肠道菌群清除降低的肝炎中所起的作用

4．2．1 CD4+T细胞

4．2．2 NKT细胞

第三节 肠道菌群清除降低Con A诱导的肝炎的原因分析

4．3．1 Foxp3+Treg细胞

4．3．2 γδ T细胞

第四节 小结

参考文献

致谢

个人简历