组成型表达几丁质酶Bt519-1工程菌株的构建及应用评价

摘要

如今，对Bt(Bacillus thuringiensis)野生型菌株的改造成为研究热点，国内外有报道构建Bt工程菌株的实例，大多数都是利用芽胞期依赖型cry基因的强启动子与结构基因一起构建融合基因，而利用几丁质酶chi基因自身的强启动子的范例甚少。寻找一个能够在营养期组成型且高效的chi基因启动子，不仅可以打破芽胞期表达的局限，而且可以提高几丁质酶的表达量，可谓一举两得。利用这样的启动子来提高Bt制剂的生防效果，达到杀虫毒力较高、抑真菌效果好、重组工程菌株遗传性状稳定等目的，成为本研究的创新所在。
　　本研究一方面从几丁质酶基因表达调控分子机制的探索入手，以其营养期启动子操纵区域的dre位点为研究材料，通过碱基定点置换技术研究dre位点对几丁质酶表达类型的影响，确定dre位点在基因表达调控过程中的重要功能。另一方面，从组成型启动子中选取启动活性最高效的作为构建工程菌株的启动子，进而利用分子生物学手段构建组成型表达几丁质酶Bt工程菌株，并对工程菌生防应用潜能进行进一步的评价，为有针对性地进行芽胞杆菌的定向分子育种提供实例。
　　本研究Bti75几丁质酶基因chiB启动子操纵区含有一个16bp(-112～-97位)的回文序列，称为dre位点(DasR蛋白应答元件)。对该区域所有碱基位点进行定点置换后，结果发现与对照启动子（-504～-89位）相比，在此基础上-99/-98位TC→GA、-102位A→C、-103位G→T、-109位C→A、-111/-110位GA→AG碱基的置换都使启动子在不诱导条件下启动的β-半乳糖苷酶的活性有所上升，其中-109位点置换后酶活上升得最高，是对照启动子启动酶活力的11倍，是全长启动子的3.3倍;而-108、-101、-105、-104四个位点的碱基置换后，发现转化子在诱导和不诱导条件下酶活很低，推测该四个碱基位点与阻遏物的结合紧密程度有关;其他碱基位点-97、-100、-106、-107、-112位虽然没有改变酶的表达类型，仍然是诱导型，但是酶的表达量发生了改变，有所上升或下降。上述结果证明chiB启动子操纵区dre位点在几丁质酶表达类型的调控中起重要作用，同时也达到了获得组成型高效启动子的目的。
　　本研究成功构建一株几丁质酶活性较野生菌提高3～3.5倍的工程菌株Bt519-1(pDM)，实现了几丁质酶ChiMY75的异源表达。对工程菌的特性研究表明重组质粒在工程菌株的发酵过程中能比较稳定地传代，四天后质粒保存率仍能达到90％以上。两株菌发酵上清液经SDS-PAGE电泳后，发现了一条大约67kD的特异蛋白条带，酶谱分析实验进一步证实，该特异表达蛋白条带是几丁质酶。
　　对于工程菌株的应用评价首先在平板上进行抑菌谱的初筛，比较菌株对10种植物病原真菌活性的差异。抑菌谱初筛实验证明几丁质酶能够增强野生型菌株的抑菌效果，改造后的工程菌对辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌和马铃薯晚疫病菌的抑制效果提升幅度较大，其中效果最显著的是辣椒疫霉病菌。另外，从初筛结果中亦发现野生菌株对油菜菌核病菌（核盘菌）的抑制率能达到100％，说明Bt519-1体内存在的某种抑菌物质能够高效拮抗核盘菌。
　　选取两种对Bt敏感型真菌——辣椒疫霉病菌和油菜菌核病菌作为盆栽防效评估实验的供试真菌，结果表明对辣椒疫霉病菌的防治上，工程菌发酵粗酶液前七天的防效最好，达到73％，比野生型提高了38％，并且持续时间长，于第十天与野生型的防效差别最显著。油菜菌核病病叶率的温室防效结果表明，Bt519-1与Bt519-1(pDM)发酵上清液分别能减少44.6％和58.4％的疾病发生率。另外，工程菌的IC50比野生型降低了40％。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 微生物几丁质酶及其应用潜能

1．1．1 几丁质酶

1．1．2 微生物几丁质酶的应用

1．2 细菌几丁质酶基因的表达调控

1．2．1 苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因的表达调控

1．3 苏云金芽胞杆菌几丁质酶工程菌的构建方法

1．3．1 经典基因工程手段

1．3．2 几丁质酶基因定向进化

1．4 苏云金芽胞杆菌体内抑真菌物质的研究

1．4．1 几丁质酶

1．4．2 Zwittermicin A(ZwA)

1．4．3 自身诱导物抑制蛋白Aii

1．5 本研究的内容、目的及意义

1．5．1 研究的目的及意义

1．5．2 主要研究内容

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试细菌、真菌以及植物材料

2．1．2 质粒及各种培养基

2．1．3 实验使用化学试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 Bti75几丁质酶基因chiB启动子碱基定点置换片段的获得

2．2．2 启动子碱基定点置换片段及载体的酶切、连接、转化和筛选

2．2．3 苏云金芽胞杆菌Bti75菌株的电转化实验

2．2．4 高效组成型表达几丁质酶ChiMY75重组质粒的构建

2．2．5 苏云金芽胞杆菌工程菌株Bt519-1(pDM)的构建

2．2．6 Bt519-1(pDM)工程菌株的特性表征

第三章 结果与分析

第一部分 chiB启动子dre位点功能的确定及组成型高效启动子的获得

3．1 Bti75几丁质酶基因chiB启动子操纵区dre位点功能的确定

第二部分 杀虫抗病工程菌株的构建及应用

3．2 抗病杀虫工程菌株Bt519-1(pDM)的构建

第四章 讨论

4．1 外源基因及Bt野生型受体的选择

4．2 苏云金芽胞杆菌最佳电转化条件的摸索

4．3 微生物分子定向育种技术的应用

4．4 Bt519-1及其工程菌对盆栽植物的防效评价

4．5 苏云金芽胞杆菌几丁质酶基因的操纵区域功能的探讨

第五章 结论

参考文献

致谢

个人简历