落叶松杂种生长发育相关基因的SNP分析及黑杨三倍体速生相关基因的功能验证

摘要

日本落叶松杂种具有生长快、木材优质、抗病力强等特征，是我国重要的用材树种，其杂种优势形成机制一直受到广泛关注。由于日本落叶松基因组大、遗传背景复杂等特点，基因组的研究一直落后于其他物种。本研究以转录组测序为基础，从单核苷酸多态性角度入手，选取候选SNP位点较多的4CL、EF2、Susy、COL、CA、PAL、CLV1、UGPase、E2九个生长发育相关基因进行cDNA全长克隆测序，分析其SNP位点发生率、转换和颠换的数量和比例，预测SNP位点对蛋白二级结构的影响，与Genbank数据库中的其他种属对应序列比对，进行系统进化树的构建与同源性分析，探究基因差异表达与杂种优势的相关性。同时以转黑杨基因拟南芥品系PtISPS(F3)、PtAIM1(F1)、PtGDSL(F1)和PtClpC1(F1)为材料，观察和记录其表型，验证其功能.主要研究结果如下:
　　1.从日本落叶松中成功克隆得到La4CL、LaEF2、LaSusy、LaCOL、LaCAX、LaPAL、LaCLV1、LaUGPase、LaE2九个基因全长cDNA。
　　2.通过生物信息学方法发掘目的基因SNP位点，本研究所得SNP发生率分布于1SNP/238.20 bp至1SNP/20.73 bp之间，平均SNP频率为1SNP/38.43bp，明显高于针叶树种的1SNP/50 bp，表明日本落叶松SNP发生率在针叶树种中处于较高水平。
　　3.La4CL、LaCOL、LaPAL和LaE2四个基因的SNP符合“单核苷酸多态性多发生于T和C之间”的理论，La4CL、LaCOL、LaPAL、LaCLV1、LaUGPase、E2五个基因的转换和颠换比值分布于1.5-2.5之间，大致符合“生物体中约2/3的单核苷酸变异是A/G和C/T转换类型”的理论。
　　4.LaSusy基因SNP分析表明，该基因内部的光响应元件box4和顺式作用元件ARE内出现SNP位点，其中ARE为错义突变，并引起了蛋白质二级结构的改变，但是否对蛋白质功能产生影响，还需要进一步实验证明。
　　5.实验结果表明，Larix82×Larix61子代CAPX基因表达量为加性表达，其余组合各基因的表达模式均为非加性表达，暗示基因的非加性表达与杂种优势形成相关。
　　6.日本落叶松Larix82和Larix13组合相对于其他三组组合具有更大的优势率。
　　7.转PtISPS基因拟南芥与野生型相比，具有生物量增大、结实早、结实率增加等性状，推测可能是异戊二烯类化合物合成途径的复杂网状调控提高了植物赤霉素的产量，进而引起生物量增大和早花的表型出现。
　　8.转PtAIM1拟南芥F2表现出生物量减小、生长发育迟缓、晚花性状。转PtGDSL、PtClpC1拟南芥具有生物量减小、生长发育缓慢性状。转入的基因在拟南芥中表现出与其在黑杨中不同的性状，推测可能是由于黑杨与拟南芥基因调控差异较大，黑杨来源的蛋白质在拟南芥中未能形成正确的构象;也可能是由于外源基因的插入位点破坏了拟南芥基因的结构，影响了拟南芥正常发育。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

第一节 单核苷酸多态性研究进展概述

1．1．1 概述

1．1．2 SNP研究意义

第二节 本研究所涉及基因的研究进展

1．2．1 4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate：CoA ligase，4CL)

1．2．2 转录延伸因子(elongation factor，EF)

1．2．3 蔗糖合成酶(sucrose synthase，Susy)

1．2．4 constans-like基因(COL)

1．2．5 Ca2+／H+反向转运体(Ca2+／H+ exchanger，CAX)

1．2．6 苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)

1．2．7 CLV1基因(CLAVATA)

1．2．8 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glueosepyrophosphorylase，UGPase)

1．2．9 泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)

1．2．10 异戊二烯合成酶(isoprene synthase，ISPS)

1．2．11 烯酰-CoA水合酶(enoyl-CoA hydratase，AIM1)

1．2．12 GDSL脂肪酶(GDSL lipase，GDSL)

1．2．13 蛋白酶Clp(protease Clp，Clp)

第三节 选题意义与研究内容

第二章 材料与方法

第一节 实验材料与试剂

2．1．1 植物材料

2．1．2 主要试剂及配置

2．1．3 引物设计

第二节 实验方法

2．2．1 总RNA提取和cDNA合成

2．2．2 9个与生长发育相关基因全长cDNA序列的克隆

2．2．3 目的基因序列的生物信息学分析

2．2．4 实时定量PCR(qRT-PCR)分析

2．2．5 转基因拟南芥的筛选与功能鉴定

第三章 结果与分析

第一节 候选基因的杂合性分析

第二节 日本落叶松材料总RNA的提取

第三节 九个基因SNP相关结果与分析

3．3．1 La4CL

3．3．2 LaEF2

3．3．3 LaSusy

3．3．4 LaCOL

3．3．5 LaCAX

3．3．6 LaPAL

3．3．7 LaCLV1

3．3．8 LaUGPase

3．3．9 LaE2

第四节 转PtISPS、PtAIM1、PtGDSL和PtClpC1基因拟南芥功能验证

3．4．1 转基因拟南芥发芽率比对分析

3．4．2 转基因拟南芥根长的比较分析

3．4．3 转基因拟南芥表型鉴定

第四章 讨论

第一节 日本落叶松九个基因的克隆测序和结构分析

第二节 基因差异表达和杂种优势的相关性

4．2．1 9个基因的表达模式分析

4．2．2 基因差异表达与杂种优势

第三节 SNP在落叶松育种中的价值

第四节 转黑杨基因拟南芥的功能鉴定

第五章 结论

附录

参考文献

致谢

个人简历