基于多马来酰亚胺交联分子的siRNA纳米给药体系的构建及其RNA干扰效果的研究

摘要

RNA干扰（RNAi）是生物进化过程中遗传下来的一种利用dsRNA对基因的表达进行调控的分子机制。1998年，Fire和Mello提出了RNA干扰理论，并在2006年获得了诺贝尔生理医学奖。RNAi机制模型分为两个阶段:起始阶段和执行阶段。起始阶段是指dsRNA转化成小干扰RNA(small interfering RNA:siRNA)的过程，在执行阶段，siRNA与较大的核糖核蛋白相结合形成RNA诱导沉默复合体(RISC)，RISC可以通过siRNA序列对mRNA进行序列特异性的识别，并将mRNA切割降解掉，抑制其翻译。2001年，由Tuschl等人研究发现，在哺乳动物细胞中，合成的小干扰RNA(siRNA)同样具有诱导基因沉默的功效，自此科学家们就开始致力于研发出能够治疗各种疾病的基于siRNA的治疗药物。理论上来说，根据任何我们感兴趣的基因所对应的mRNA的序列都可以设计出与之相对应的siRNA，对于那些传统药物无法治疗的基因也可以达到基因沉默的效果。即使经过了这么多的有关RNAi的体外和体内研究，直至目前也还没有一种药物经过FDA的批准进入药物市场，这是因为，要想完全实现siRNA的药物应用，还有大量的胞内和胞外障碍需要克服，比如血清稳定性，脱靶效应，细胞毒性等。
　　针对siRNA药物应用所面临的稳定性差，细胞通透性低，以及存在脱靶效应，毒性和免疫反应，给药体系构建困难等一系列问题，我们尝试构建了一种新型siRNA纳米给药体系。大量的研究中所构建的siRNA纳米颗粒中，作为药效团的siRNA含量较低，含有大量的辅料。因此，通过提高siRNA纳米颗粒中的siRNA载药量，来降低由辅料所带来的毒性或免疫反应的可能性，是siRNA药物应用的关键，基于此种思想，我们希望通过最少的化学修饰直接将siRNA构建为纳米颗粒。经过设计，实验室的前人设计合成了一种中心为N连接有三端马来酰亚胺的迈克尔受体分子(3M)，3M与5'端连接有巯基修饰的核苷酸单链进行迈克尔加成反应后，形成了三联体RNA。通过条件控制，该三联体RNA通过正义链和反义链之间的退火，可形成分散良好，粒径在纳米级别的siRNA纳米颗粒。为了进一步在该siRNA纳米颗粒上修饰一些脂质基团以帮助其进入细胞，我们又进一步合成出了中心为C具有不同长度脂肪链修饰的三头迈克尔受体分子，通过相似的构建方法，构建出了具有不同长度脂肪链修饰的siRNA纳米颗粒。这些纳米颗粒具有良好的生物学功能，它们在细胞水平具有较好的干扰效果，同时也具有较好的RNase耐受性和血清稳定性，这些发现有利于这些siRNA纳米颗粒进一步应用于活体水平。为了进一步将这些siRNA纳米颗粒用于siRNA给药方法的研究，我们又进一步合成出了连接有炔丙基修饰的三头迈克尔受体，以期在之后的研究中通过简单的Click反应连接上更多种类的修饰基团。

目录

声明

摘要

第一章 研究背景

第一节 RNA干扰机制及其发展历程

1．1．1 RNA干扰的起源及其发展历程

第二节 siRNA药物应用的发展及现状

1．2．1 siRNA药物应用的潜力及所具备的的优势

1．2．2 药物应用的研究现状

第三节 本文的研究目的和主要研究内容

第二章 基于马来酰亚胺交联分子的siRNA纳米给药体系的构建及其RNA干扰效果的研究

第一节 实验设计

第二节 实验部分

2．1．1 试剂与仪器

2．1．2 三头迈克尔受体小分子的合成

2．1．3 RNA三联体的合成及表征

2．1．4 siRNA纳米颗粒的构建

2．1．5 siRNA纳米颗粒的物理特性表征

2．1．6 siRNA纳米颗粒的性质研究

2．1．7 siRNA纳米颗粒的生物活性测定

第三章 总结

参考文献

致谢

附录

个人简历

在学期间发表的学术论文和研究成果