大鼠c-ski基因siRNA真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的干扰效果观察

摘要

目的 构建大鼠c-ski基因的特异性siRNA沉默质粒,并评价其在大鼠皮肤原代成纤维中的干扰效果.方法 采用pSUPER质粒构建大鼠c-ski基因siRNA的重组真核表达质粒,转染大鼠皮肤成纤维细胞,采用荧光纤维镜观察转染效率,BrdUELISA法检测转染后细胞增殖情况并作为其干扰效果的初步筛选,定量PCR、免疫组化法检测c-ski基因和蛋白的表达变化.结果 构建3个c-Ski siRNA沉默质粒,按照质粒(μg)/脂质体(μl)1:2.5的比例转染时效率最高,约为53.5%.转染c-Ski siRNA沉默质粒后,细胞增殖降低,且抑制效果与转染剂量成正比.定量PCR、免疫组化法结果显示转染后c-ski基因表达下调51%(P<0.01),蛋白表达明显降低.结论 c-Ski沉默质粒构建成功,瞬时转染大鼠皮肤原代成纤维细胞后可以显著抑制e-ski基因和蛋白的表达.