物理场作用下的蛋白质折叠和酶催化研究

摘要

当今的蛋白质物理学和化学主要关注两个问题:蛋白质折叠问题和蛋白质结构与功能之间的关系。折叠过程和折叠后蛋白质所显示出的生物功能（特别是酶催化功能）是蛋白质研究的主线。酶催化是蛋白质最为重要的功能之一。
　　蛋白质折叠的机制是以尿素或盐酸胍作为变性剂通过研究蛋白质的去折叠的途径进行探索的。与变性剂诱导的去折叠不同，我们利用电场拉伸蛋白质分子以引发蛋白质的去折叠反应。我们观察到强度为1.5 V/cm的静电场能够有效地诱导牛血清白蛋白(BSA)的去折叠过程。电场诱导的去折叠行为与变性剂诱导的行为十分不同，但却类似于聚合物凝胶的蠕变。在移除电场后蛋白质构象能够在一定程度上恢复到天然状态。但是这种再折叠是一个缓慢的过程，而且它并不遵从变性剂诱导的去折叠后的再折叠规律。电驱动的蛋白质变性和复性是一个被用来测量的蛋白质折叠途径和动力学简单而易于控制的技术。它可为蛋白质折叠问题的研究提供一种新的工具。
　　蛋白质以二态或多态动力学进行折叠。氨基酸在不同的动力学中扮演着十分不同的角色。许多容易形成α-螺旋、β-折叠片和转角规整二级结构的残基能够加快二态小蛋白的折叠速率。亲水的柔性残基能够促进多态大蛋白的折叠速率。对于一个氨基酸，极性、体积、可及表面积、等电点、残基暴露和相转移能对蛋白质折叠动力学的影响不大。半胱氨酸是一个特殊的氨基酸，它强烈加速二态折叠，但却减速多态折叠。这一结果不仅为蛋白质结构预测提供了一种见解，而且可以对改变折叠动力学的点突变进行指导。
　　电化学生物传感器通常用于许多痕量物质的侦测。本文我们开发出另一种方法将生物传感器用于酶活性检测，通过测量在各种底物和抑制剂的浓度下的电解电流来跟踪酶的电化学动力学行为。考察了在辣根过氧化物酶电极上H2O2的稳态和前稳态还原反应。结果表明只有稳态电流随底物浓度的变化服从严格的Michaelis-Menten方程，而稳态电流随抑制剂浓度的变化有一个明显的间断。对于前稳态时段，无论是催化还是抑制都显现出了一个输出电流的突变。这些现象是普遍存在的，很可能潜藏着生物化学的基本原理。
　　我们利用所设计的电化学生物传感器来监测酶活性对超声刺激的响应。在辣根过氧化物酶(HRP)作用下的H2O2的还原反应伴随着生物传感器电流的升高，升高的幅度与酶活性成正比。该生物传感器的快速响应使得连续性检测酶活性的动态变化成为了可能。由此，我们提出了一种基于该生物传感器的酶活性检验方法，该方法可实时估价超声对酶活性的影响。结果表明，当频率接近一个给定的数值时酶活性趋于一个极大值。随着超声功率的增高，酶催化的速率变得更快。超声振荡不仅是改善传质的主要原因，而且也在立体化学上使酶构象得到了改良。
　　我们还考察超声辐射和声波对酶催化水解反应的影响。超声波和声波是在不同频率范围内的机械振动，它们能够影响不同酶蛋白的催化能力。这一结果可为理解酶的催化机理提供一个出发的起点。

目录

声明

摘要

第一章 前言

第一节 概述

第二节 蛋白质去折叠和再折叠的实验研究

第三节 蛋白质折叠动力学的理论研究

第四节 酶传感器

第五节 超声波对酶催化的影响

第六节 论文选题和构思

参考文献

第二章 电场对蛋白质折叠的作用

第一节 实验部分

2．1．1 化学试剂

2．1．2 仪器设备

2．1．3 实验步骤

第二节 结果与讨论

2．2．1 电场拉伸原理

2．2．2 蛋白质去折叠检测原理

2．2．3 电场拉伸蛋白质实验

2．2．4 电场拉伸前后蛋白质的折叠状态

2．2．5 去折叠过程

2．2．6 再折叠过程

第三节 本章小结

参考文献

第三章 蛋白质折叠的动力学预测

第一节 材料与方法

3．1．1 数据

3．1．2 分析

3．1．3 弃一法交叉检验分析

第二节 结果与讨论

3．2．1 模型

3．2．2 预测

3．2．3 氨基酸性质对折叠的影响

第三节 本章小结

参考文献

第四章 酶传感器分析酶催化的功能

第一节 实验部分

4．1．1 生化试剂

4．1．2 仪器设备

4．1．3 实验步骤

第二节 结果与讨论

4．2．1 模型

4．2．2 电化学生物传感器

4．2．3 电化学酶活性检测

4．2．4 电化学酶抑制检测

4．2．5 对实验结果的解释

第三节 本章小结

参考文献

第五章 声场对酶催化功能的作用

第一节 实验部分

5．1．1 生化试剂

5．1．2 仪器设备

5．1．3 实验步骤

第二节 结果与讨论

5．2．1 超声振动对酶活性的影响

5．2．2 声波对酶活性的影响

5．2．3 超声促进酶催化的实时检测

第三节 本章小结

参考文献

总结论

致谢

[附] 攻读博士学位期间的发表物和科研情况