门多萨假单胞菌NK-01基因无痕敲除体系的建立与应用

摘要

门多萨假单胞菌NK-01（Pseudomonas mendocinaNK-01）是一株可以利用葡萄糖作为单一碳源，同时合成中长链聚羟基脂肪酸酯（Medium-chain-length polyhydroxyalkanoates, PHAMCL）以及褐藻寡糖(Alginate Oligosaccharides, AO)的革兰氏阴性菌。目前，有关PHA与褐藻寡糖的合成途径已经阐明，并且已经对该菌株进行了全基因测序。但对基因组信息进行分析后发现，在P. mendocina NK-01的基因组中存在着大量冗余的非必需基因以及基因组岛。本研究旨在建立一种无痕的基因敲除体系，利用基因敲除的方式对基因功能进行研究。为基因组精简进行研究。
　　upp基因是尿嘧啶磷酸核糖转移酶（uracil phosphoribosyltransferase， UPRTase）的编码基因，也是现阶段广泛应用于基因无痕敲除系统中的一种反向筛选标记，利用微生物自身 upp基因的缺失对5-氟尿嘧啶产生抗性，从而实现目的片段的敲除。
　　本研究根据上述原理，在P. mendocinaNK-01中建立了upp反向筛选标记结合自杀质粒的无痕基因敲除系统，成功敲除褐藻寡糖合成相关基因 algA，并对P. mendocinaNK-01基因组进行了部分基因敲除，大小分别为8kb、9kb、10kb、32kb、41kb以及51kb，共151kb，占全基因组序列的3％，从而对敲除系统进行了可行性的验证，进一步为P. mendocinaNK-01基因组的精简奠定了基础。
　　另外，本实验还对上述所构建的基因突变菌种进行了生长状况、摇瓶发酵、分批发酵以及相关产物的研究及测定。与野生型相比，ΔalgA基因突变菌株 P. mendocina NK-01ΔalgA生长情况与野生型类似，但PHA产量有一定的提升，为0.330g/L，是野生型的1.4倍。然而，精简了151kb的突变菌株P. mendocina NK-01Δ151，生长状况以及产物产量都有所下降，褐藻寡糖与PHA的产量分别为0.258g/L以及0.160g/L（野生型P. mendocinaNK-01褐藻寡糖产量为0.335g/L，PHA产量为0.231g/L）。但上述两种基因突变菌种所合成的PHA的结构与物理性质并没有发生改变。

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第一章 绪论

第一节 基因无痕敲除研究概述

1.1.1 基因重组基本概念与分类

1.1.2 微生物同源重组系统——RecA系统

1.1.3 反向筛选标记

1.1.4 常用的基因无痕敲除系统

第二节 基因组精简概述

1.2.1 合成生物学概念

1.2.2 基因组精简

1.2.3 最小基因组

第三节 本研究的意义与主要内容

1.3.1 本研究的意义

1.3.1 本研究的主要内容

第二章 门多萨假单胞菌NK-01基因无痕敲除体系的建立

第一节 实验材料与设备

2.1.1 实验菌株与质粒

2.1.2 引物设计

2.1.3 培养基与相关试剂

2.1.4 实验仪器与设备

2.1.5 工具酶以及相关基因操作产品

2.1.6 其他化学药品

第二节 实验操作与方法

2.2.1野生型P. mendocinaNK-01对于5-FU敏感性测试

2.2.2P. mendocinaNK-01基因组的提取

2.2.3 DNA片段的验证与纯化

2.2.4 大肠杆菌DH5α/S17-1感受态的制备

2.2.5 感受态细胞的转化

2.2.6 质粒的提取

2.2.7 二亲结合

2.2.8 upp突变基因的T载体克隆构建

2.2.9 upp基因打靶载体pEx18Tc-Δupp的构建

2.2.10 upp基因缺失突变菌株的构建

第三节 实验结果与分析

2.3.1野生型P. mendocinaNK-01与upp基因缺失菌株对5-FU抗性的验证

2.3.2 upp突变基因T载体构建

2.3.3 打靶载体pEx18Tc-Δupp的构建

2.3.4 upp基因缺失突变菌株的构建

2.3.5 小结与讨论

第三章 门多萨假单胞菌NK-01无痕敲除体系的应用

第一节 实验材料与设备

3.1.1 实验菌株与质粒

3.1.2 引物设计

3.1.3 培养基与相关试剂

3.1.4 实验仪器与设备

3.1.5 工具酶以及相关基因操作产品

第二节 实验操作与方法

3.2.1 打靶载体pEx18Tc-upp的构建

3.2.2 利用反向筛选标记upp结合自杀质粒进行基因敲除（以algA基因敲除为例）

3.2.3algA基因回补菌株P. mendocinaNK-01 △upp-algA的构建

第三节 实验结果与分析

3.3.1 打靶载体pEx18Tc-upp的构建

3.3.2 algA基因缺失突变菌株的构建

3.3.3algA基因回补菌株P. mendocinaNK-01 △upp-algA的构建

3.3.4 大片段基因缺失突变菌株的构建

3.3.4 小结与讨论

第四章 门多萨假单胞菌NK-01突变菌株发酵性能的研究

第一节 实验材料与设备

4.1.1 实验菌株与质粒

4.1.2 引物设计

4.1.3 培养基与相关试剂

4.1.4 实验仪器与设备

4.1.5 工具酶以及相关基因操作产品

4.1.6 其他化学药品

第二节 实验操作与方法

4.2.1野生型P. mendocinaNK-01及其突变菌种生长曲线的测定

4.2.2野生型P. mendocinaNK-01及其突变菌种生长代时的测定

4.2.3野生型P. mendocinaNK-01及其突变菌种摇瓶发酵实验

4.2.4野生型P. mendocinaNK-01及其突变菌种分批发酵实验

4.2.5 发酵产物PHA与褐藻寡糖的提取方法

4.2.6 褐藻寡糖的定量实验

4.2.7 PHA性质的检测

4.2.8 突变菌株PHA相关基因转录分析

第三节 实验结果与讨论

4.3.1野生型P. mendocinaNK-01及其突变菌种生长曲线

4.3.2野生型P. mendocinaNK-01及其突变菌种生长代时

4.3.3野生型P. mendocinaNK-01及其突变菌种摇瓶发酵实验

4.3.4野生型P. mendocinaNK-01及其突变菌种分批发酵实验结果

4.3.5 PHA性质的检测结果

4.3.6 突变菌株PHA相关基因转录分析结果

4.3.7 本章小结与讨论

第五章 总结与展望

第一节 总结

第二节 展望

5.2.1 无痕敲除体系优化

5.2.2 基因精简菌株的优化

参考文献

致谢

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果