具有微纳交替结构的多层支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

摘要

虽然用于骨组织工程的支架繁多，但其各自均有不足之处，很难满足目前对骨组织修复，替代，重建的要求。因此，制备生物相容性好，能够模仿细胞外基质，力学强度适宜，而且具有良好成骨作用的新型骨组织工程支架或者改性支架成为关键。在本论文中，基于目前骨组织工程存在的问题，制备了一种新型具有微纳交替结构的多层支架，通过向其中载入大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)和骨形态发生蛋白-2（BMP-2），研究了该材料的成骨分化功能。
　　首先，我们利用静电纺丝技术制备了PCL纳米纤维膜，并通过扫描电子显微镜(SEM)对其表面形貌和直径大小进行了表征。结果发现，纤维较光滑，呈无规分布，表面形貌良好，平均直径为282 nm。接着，我们自行设计、装配了微流控装置，并利用微流控技术制备了海藻酸钙水凝胶微球，通过体视显微镜，流变仪等对微球的表面形貌和流变性能进行了考察。结果表明，微球呈球形，大小均一，而且分散均匀。同时，确定了其粘弹性，也证明了该水凝胶的三维交联网络结构。之后，将静电纺丝制备的纳米纤维膜和微流控制备的微球通过层层不断叠加，最终得到一层纤维膜，一层微球的多层微纳结构支架。
　　其次，我们从大鼠胫腓骨中提取了原代的骨髓间充质干细胞(rBMSCs)，将其包裹进海藻酸钙微球中，利用活死细胞染色和Alamar blue法考察了微球包裹细胞的生存状态和增殖情况，结果发现微球中的细胞大部分处于存活状态，存活率较高(大于85％)。包裹的细胞与空白对照组相比，有较缓慢的增殖。接着，将干细胞和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)共同载入微球和微纳结构中，检测其碱性磷酸酶（ALP）的表达量，发现含有BMP-2的微纳结构支架组在14和21天时，均具有最高的ALP表达量。通过茜素红S(Alizarin Red S)染色定性和定量地考察了体外培养21天时钙盐的沉积。结果与21天时的ALP结果类似。
　　最后，我们进行了体内动物实验，将微纳结构支架植入到SD大鼠皮下，考察其异位成骨作用。在植入4周和8周后，利用组织学染色和免疫组化的方法，检测了体内异位成骨效果。结果表明:植入支架8周后，根据H&E染色显示，所有支架均有组织的长入。Masson染色表明，除了纯微纳结构支架组外，含有骨髓间充质干细胞(rBMSCs)或/和骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的微球支架和微纳结构支架均有类似骨组织结构的产生。对骨钙素的免疫组化结果表明，含有骨髓间充质干细胞(rBMSCs)或/和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的微球支架和微纳结构支架确实呈现出阳性染色反应，证明确实发生了异位成骨现象。综上，说明了该新型微纳结构支架在骨组织工程领域具有较大的应用潜能。