微结构一致刚度不同的脱钙骨支架对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

摘要

骨是一种有生命的器官，内有血液循环，具有一定的自我愈合修复能力，而由外伤、感染、肿瘤等造成的大块骨缺损至今仍未有有效的解决方法。骨组织工程被认为是目前治疗大段骨缺损最有希望的途径。基质力学影响干细胞的粘附、迁移、增殖和分化，然而现有的关于基质力学在支架材料构建方面的研究主要集中在二维(two-dimensional,2D)或者准三维(quasi-three-dimensional,quasi-3D)条件下，而且大部分3D支架的制备方法在改变基质刚度的同时也改变了其3D微结构，难以考察基质力学单一因素对干细胞生物学行为的影响。本文通过对3D脱细胞骨支架进行不同时长脱钙，构建了一种微结构一致而基质刚度不同的新型3D脱钙骨支架材料。首先离体考察了不同基质刚度脱钙骨支架对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)细胞相容性以及成骨分化的影响，然后通过皮下埋植实验考察了不同基质刚度脱钙骨支架对细胞浸润、胶原纤维沉积以及内源性细胞成骨分化的作用。本文的主要研究内容和结果如下：
　　①微结构一致基质刚度不同脱钙骨支架的制备及表征
　　通过对脱细胞骨支架进行不同程度的脱钙处理，成功制备了微结构一致基质刚度不同的脱钙骨支架，该支架具有良好的孔径尺寸和孔隙率，并且保留了天然骨的细胞外基质成分。压缩实验所测得不同基质刚度脱钙骨支架的弹性模量分别为66.06±27.83MPa(高刚度组)、26.90±13.16MPa(中刚度组)和0.67±0.14MPa(低刚度组)。微型计算机断层扫描(micro computede tomography,micro-CT)结果显示脱钙前和脱钙后支架的微结构并未发生显著性变化。
　　②不同基质刚度脱钙骨支架在体外对MSCs细胞相容性及成骨分化的影响
　　体外Live/dead染色显示不同基质刚度支架均有利于MSCs的粘附和生长。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙蛋白(osteocalcin,OC)的免疫组化染色表明在体外复合培养21天时低刚度组支架最有利于促进MSCs的成骨分化。
　　③不同基质刚度脱钙骨支架在皮下对细胞浸润、胶原纤维沉积以及内源性细胞成骨分化的影响
　　皮下埋植实验表明各组支架具有不同的细胞浸润能力，脱钙骨支架的细胞浸润能力优于脱细胞骨支架(对照组)。Masson染色显示皮下埋植4周低刚度组支架具有明显的促进胶原纤维生成和沉积的作用，而皮下埋植8周时，胶原纤维的生成和沉积进一步增强。免疫组化检测显示皮下埋植4周低刚度组支架促进OPN和OC阳性表达的能力最强。以上结果说明低刚度组支架更有利于促进内源性细胞的成骨分化。
　　综上所述，本文制备的3D微结构一致基质刚度不同的骨组织工程支架在体外可以促进MSCs的粘附、生长和成骨分化，在皮下有利于细胞浸润、胶原纤维沉积，促进内源性细胞的成骨分化。本文结果为基质力学在3D支架材料方面的研究提供一新的构建方法。

目录

1 绪 论

1.1 问题的提出

1.2 国内外研究现状

1.3 本文研究目的、意义及主要内容

1.4 本实验创新点

2 不同基质刚度脱钙骨支架的制备及表征

2.1 引言

2.2 实验材料与试剂

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论与分析

2.6 本章小结

3 不同基质刚度脱钙骨支架在体外对MSCs相容性及成骨分化的影响

3.1 引言

3.2 实验材料与试剂

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 分析讨论

3.6 本章小结

4 不同基质刚度脱钙骨支架在皮下对细胞浸润以及成骨分化的影响

4.1 引言

4.2 实验材料与试剂

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 分析讨论

4.6 本章小结

5 结论及后续工作展望

5.1 主要结论

5.2 后续工作建议

致谢

参考文献

附录

A．作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录