兔出血症病毒分离鉴定VP60基因克隆及RT-PCR检测方法的建立

摘要

兔出血症(Rabbithemorrhagicdisease，RHD)是由兔出血症病毒(RHDV)引起的兔的急性高度接触性传染病，给养兔业造成巨大的经济损失，为了在生产中防制该病，有必要对毒株进行分离鉴定及其特性研究，以及建立一种灵敏、准确的检测方法。 本研究从兔病料中分离鉴定出了3株有不同血凝性的兔出血症病毒，分别命名为RHDV-whn-1，2，3，毒株经兔体传至3代后，能引起RHDV抗体为阴性的家兔发病及死亡呈现稳定的规律性。其中whn-2株血凝效价为1∶640，whn-1，3的血凝效价仅分别为1∶5，1∶10，但琼扩实验及对流免疫电泳均能看到清晰的沉淀线，电镜负染可见大量球形、核心密度不同、大小约30nm的病毒粒子。 根据GenBank中的RHDV的全基因序列，设计1对长为29bp的引物，在两引物的5’端加入EcoRI和XbaI酶切位点，对兔出血症病毒VP60基因进行RT-PCR扩增，扩增出约1.7kb的衣壳蛋白VP60基因的完整片段，将其插入克隆载体pMD18-T上，构建重组质粒pMD-VP60-1，2，3，对重组质粒的测序显示，VP60基因全长1740bp，共编码579个氨基酸，并在GenBank中注册(登录号分别为DQ069280，DQ069281，DQ069282)。 将3株RHDV及世界上其它RHDV，以及RCV，EBHSV的VP60基因序列进行多序列比对，结果显示whn-1与whn-2同源性为96.1％，whn-1与whn-3同源性为96.5％，whn-2与whn-3同源性为99.4％，比对序列中所有RHDV与RCV的同源性为84.7％-86.4％，与EBHSV的同源性为69.0％-70.5％，而RHDV各毒株之间同源性为89.7％-99.4％，表明VP60是一个很保守片段。在遗传进化上，世界各地的RHDV毒株在核苷酸水平上趋向4个支谱系，在氨基酸水平上趋向3个支谱系，谱系间没有明显的地理或时间特征，RHDV-whn-1，2，3株分布在2个不同的谱系中，与RHDV为同一属的EBHSV和RCV分别组成两支不同的谱系，以上结果对认识RHDV的变异趋势具有参考价值。利用软件分析了分离毒株的分子量、疏水性、抗原性、表面可能性、密码子偏爱性和二级结构等分子结构特征，并推测可能与其血凝性最相关的氨基酸位点为P2区的第304、305位，及E区的第432位；其次是F区的第480、508位。该分析结论在国内外未见系统报道，为RHDV的分子生物学增添了新的资料。 根据GenBank中的衣壳蛋白VP60基因内的保守序列，用Primer5.0设计出1对可扩增出VP60基因内部约496bp的部分片段的引物，建立了检测RHDV的RT-PCR方法，并采用该RT-PCR方法对人工致死家兔体内的RHDV进行了检测；该方法特异性强，重复性好，灵敏度高，检测RHDV的RNA的灵敏度可达2.15ug/ml。本研究建立的优于HA的灵敏度高、特异性好的RT-PCR方法及其RHDV抗原检测结果在国内未见报道。 本研究分离鉴定出有不同血凝性兔出症病毒株，并对其衣壳蛋白VP60基因进行了克隆和相应生物信息学分析，建立了检测RHDV的RT-PCR方法，为RHDV的地方毒株的分子生物学及其结构特征增添了新的资料，并为生产中RHDV的检测提供了科学依据和一种灵敏、准确的检测方法。

目录

文摘

英文文摘

论文独创性声明及关于论文使用授权的声明

1、前言

2、材料

3、方法

4、实验结果

5、讨论

6.结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的文章