兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法的建立

摘要

本文选用原核系统pPRoEXTMHta载体，构建了RHDV—TP毒株VP60基因原核重组质粒，表达大小约50KD特异蛋白，Westernblot鉴定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别。将表达蛋白经SDS-PAGE电泳切胶纯化后免疫BALB/C小鼠，免疫血清经RHDV全病毒ELISA检测，效价可达1：3200～1：6400，2只阴性对照BALB/C小鼠的HI均小于1/10，而pPRoVP60重组蛋白经过胶条免疫过的5只小鼠的HI均在1/40～1/100，经琼脂扩散试验检测效价为1：16。 将重组蛋白经试剂盒纯化和尿素梯度透析后作为包被抗原，建立RHDV抗体间接ELISA检测方法，优化反应条件为：抗原包被浓度为0.075μg/mL，7％马血清封闭，以大肠杆菌提取物稀释被检兔血清等。并对该方法进行敏感性、特异性、符合性、稳定性实验验证。 本试验参照RHDV-TP株VP60基因序列，在其5’端设计一对引物，扩增片段为386bp，建立了检测兔出血症病毒的RT-PCR检测方法。经过对反应参数的优化，确定了反应的最佳条件。该方法在含多种已知病原的病料中，可特异性检出RHDV，检测病料的最高稀释度为10-5稀释，且有很好的稳定性。 为检验重组蛋白对兔的免疫保护效果，将20只清洁级兔随机分成4组：单用重组蛋白组、重组蛋白加弗氏佐剂组、重组蛋白加白油佐剂组及空白对照组。通过对实验兔血清的RHDV全病毒ELISA、HI检测和对实验兔的攻毒实验，结果显示佐剂可以明显加速重组蛋白诱导机体产生抗体的进程。 本实验建立了RHDV抗体间接ELISA血清学检测方法，RHDV的RT-PCR检测方法的建立，不仅为RHDV临床提供了一个敏感、特异的检测方法，同时为RHDV在我国的分子流行病学特点研究提供理论依据，有广泛的应用前景。

目录

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摘要

第一章绪论

第二章兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及鉴定

第三章兔出血症病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

第四章兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

结论

参考文献

致谢

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