四川山地乌骨鸡IL-2、15、18、IFN-γ基因克隆测序及分子佐剂效应研究

摘要

鸡白细胞介素2(IL-2)、IL-15、IL-18及干扰素-γ(IFN-γ)是鸡体内重要的细胞因子，在鸡抗病和免疫应答反应中有重要作用。四川山地乌骨鸡是地方优良品种，具有生长快，适应性广、抗病力强等特点。目前有关四川山地乌骨鸡的IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ及其免疫学特性的研究，国内外均未见报道。克隆四川山地乌骨鸡IL-2、1L-15、IL-18及IFN-γ基因，研制分子免疫佐剂及其对疫苗的佐剂效应，提高疫苗免疫应答，有重要学术价值和应用前景。 1.本试验用RT-PCR方法从conA刺激的四川山地乌骨鸡的外周血淋巴细胞总RNA扩增了鸡白细胞介素2及γ-干扰素基因的cDNA。将分离的cDNA片段克隆到PMD18-T载体，进行序列测定分析。结果表明：鸡IL-2基因全部的开放阅读框432bp，与Genbank数据库中的序列进行同源性比较发现：山地乌骨鸡IL-2基因与其他品种鸡IL-2基因核苷酸同源性为98.4-99.5％。鸡IFN-γ基因全部的开放阅读框495bp，与GeneBank上报道的核苷酸序列同源性为97.4％-100％。四川山地乌骨鸡IL-2和IFN-γ克隆在国内外尚未见报道，本试验所克隆的鸡IL-2及IFN-γ基因，丰富了IL-2及IFN-γ基因的资源库，为进一步研究提供了基础材料。 2.用RT-PCR方法从conA刺激四川山地乌骨鸡的脾淋巴细胞总RNA扩增了鸡白细胞介素15基因的cDNA。将分离cDNA片段的克隆到PMD18-T载体，进行序列测定分析。结果表明：鸡IL-15基因基因全部的开放阅读框564bp，与Genbank上序列比较发现，山地乌骨鸡IL-15与其他序列同源性为98.9-99.8％。目前很少关于鸡IL-15的研究报道，四川山地乌骨鸡IL-15克隆在国内外尚未见报道，本试验为进一步研究鸡IL-15的疫苗佐剂效应奠定的基础。 3.本研究应用RT-PCR方法从conA刺激2h后四川山地乌骨鸡的脾脏组织总RNA扩增了IL-18基因的cDNA，将分离cDNA片段的克隆到PMD18-T载体，进行序列测定分析。结果表明：鸡IL-18基因全部的开放阅读框597bp，与GeneBank上报道的核苷酸序列同源性为96.5-100％。其中与Schneider等报道的序列完全一致。四川山地乌骨鸡IL-18克隆在国内外尚未见报道，本研究为鸡IL-18疫苗佐剂效应的研究提供了物质基础。 4.分别双酶切得到IL-2、IFN-γ、IL-15、IL-18DNA片段，将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)上。通过菌落PCR方法在转化子中筛选阳性克隆，并双酶切鉴定重组子。其中IL-15真核质粒的构建在国内尚未见报道，其中鸡IFN-γ及IL-18真核表达质粒申请了国家发明专利，专利申请号分别为：2005100213545和200510021355x。用本研究构建的真核表达质粒，制备分子佐剂，为进一步研究提供基础材料。 5.将1日龄非免疫健康雏鸡240只，分组9组，肌肉免疫(A组：空白对照，B组：空质粒pcDNA3.1，C组：IBVDNA疫苗，D组：IBVDNA-pDNAIL118，E组：Liposome/IBVDNA，F组IBVDNA-pDNAIL12，G组Liposome/IBVDNA-pDNAIL2，H组IBVDNA-pDNAIFN-γ，I组IBVDNA-pDNAIL15，前两组每组20只鸡，后面各组每组25只鸡。)通过检测血清总IgG值、IBV特异性抗体、CD4+、CD8+百分含量，分析了pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18和pDNAIFN-γ对IBVDNA的免疫佐剂效应及脂质体对pDNAIL12作用的影响。结果表明：免疫后5-29d，D、F、H、I组血清总IgG值及CD4+/CD8+百分含量都高于C组，呈差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。总IgG值：I组＞D组＞F组＞H组＞C组。D组CD4+百分含量在免疫后21d显著高于F，H，I组(P＜0.05)。CD4+百分含量为：D组＞I组＞H组＞F组＞C组。免疫后29d，且D、H、I组CD8+百分含量显著高于F组(P＜0.05)。对CD8+免疫效果比较发现：I组＞H组＞D组＞F组＞C组。D、F、I组特异性抗体水平于免疫后5-29d均高于C组，H组在5-15d低于C组，到21d约高于C组。G组血清总IgG值、IBV特异性抗体水平、CD4+、CD8+百分含量均高于F组，呈差异显著(P＜0.05)或极显著性(P＜0.01)。攻毒结果显示D、F、H、I，组死亡率，显著低于A、B、C组。G组死亡率低于F组。结果表明：pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18和pDNAIFN-γ能提高IBV免疫的细胞和体液免疫水平及攻毒保护率，对IBVDNA疫苗有免疫佐剂效应。阳离子脂质体包裹pDNAIL-2后，可提高实验对疫苗的细胞免疫和体液免疫水平及攻毒保护率。鸡IL15和IFN-γ的真核质粒免疫佐剂效应、四种分子佐剂对IBVDNA的佐剂效应的比较研究尚未见报道。对CD4+和CD8+亚类百分含量来测定细胞免疫水平较少应用于鸡免疫实验中。本试验对pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18及pDNAIFN-γ的免疫佐剂效应的比较研究，对于寻找DNA疫苗的分子免疫佐剂及不同分子佐剂之间的联合应用提供了科学依据。 6.将1日龄非免疫健康雏鸡60只，分3组，颈部肌肉注射进行免疫(A组禽流感灭活疫苗(AI)，B组AI-pDNAIL-2，C组AI-pDNAIL15)，通过检测CD4+、CD8+含量及HI抗体，分析了pDNAIL-2和pDNAIL-15对禽流感灭活疫苗佐剂效应。结果表明：B组和C组CD4+、CD8+百分含量及HI抗体水平均高于A组。B组、C组于免疫后10-23dHI抗体显著高于A组(P＜0.05)，C组HI抗体于免疫后16d显著高于A组、B组(P＜0.05)。且B组、C组HI抗体水平比A组提前5d达到5log2。免疫后10d后，C组CD4+淋巴细胞百分含量显著高于A组、B组(P＜0.05)。免疫后23d，B组CD4+淋巴细胞百分含量显著高于C组、A组(P＜0.05)。结果表明：pDNAIL2和pDNAIL15对禽流感灭活苗具有免疫佐剂效应，且pDNAIL15免疫佐剂效应在早期优于pDNAIL2，pDNAIL2免疫佐剂效应在后期效果更好。鸡IL-15分子佐剂对灭活疫苗的佐剂效应尚未见报道。本试验对鸡IL-2和IL-15分子佐剂效应进行的比较研究，为两种分子佐剂作为常规疫苗佐剂提供了科学依据。 综上所述，进行四川山地乌骨鸡IL-2、15、18、IFN-γ基因克隆测序，研究其分子佐剂效应，为鸡IL-2、15、18、IFN-γ分子佐剂与DNA疫苗及常规灭活疫苗联合应用提供了科学依据。

目录

论文独创性声明及关于论文使用授权的声明

文献综述细胞因子及其疫苗佐剂效应研究进展

前言

第一章　四川山地乌骨鸡IL-2及IFN-γ基因的克隆与序列分析

第二章　四川山地乌骨鸡IL-15基因的克隆与序列分析

第三章　四川山地乌骨鸡IL-18基因的克隆

第四章　鸡IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ真核表达载体的构建及鉴定

第五章　pDNAIL-2、pDNAIL-15、pDNAIL-18及pDNAIFN-γ分子佐剂制备及其对IBV DNA疫苗佐剂效应研究

第六章、真核表达质粒pDNAIL-2和pDNAIL-15对禽流感灭活疫苗免疫增强作用研究

结论

致谢

参考文献

在读期间发表的文章