IFA检测石蜡和冰冻切片中鸭病毒性肿头出血症病毒方法建立及在检测病毒鸭体内侵染规律的应用

摘要

本文开展了间接免疫荧光(Inadirect Immunofluorescence Assay，IFA)检测石蜡切片与冰冻切片中鸭病毒性肿头出血症病毒(Duck Swollenhead。HaemorrhagicDisease Virus，DSHDV)方法建立，应用IFA检测DSHDV在实验感染鸭体内侵染规律等系列研究，获如下结果： 1. IFA检测石蜡切片与冰冻切片中鸭病毒性肿头出血症病毒方法建立及其比较 用差速离心纯化：DSHDV，将纯化：DSHDV免疫家兔制备兔抗DSHDV高免血清，并以High Q阴离子柱层析纯化出兔抗DSHDV IgG，建立间接免疫荧光(IFA)检测石蜡切片与冰冻切片中DSHDV的方法；利用建立的IFA对28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭不同组织器官以进行检测。IFA检测DSHDV感染死亡鸭石蜡切片肝脏为阳性，检测鸭瘟病毒、禽流感病毒(H5N1)、鸭病毒性肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌感染死亡鸭肝脏呈阴性；IFA检测28日龄人工感染DSHDV死亡鸭的不同组织器官石蜡切片，心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性或强阳性；该法具有直观、特异性强的优点，应用于：DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位具有良好效果，可用于DSHDV感染的实验室诊断、病原在鸭组织细胞中分布研究。IFA检测28日龄人工感染DSHDV死亡鸭的不同组织器官冰冻切片，心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、哈德氏腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性或强阳性；该法敏感性高于石蜡切片且能快速出结果，可用于临床快速诊断研究。 2. DSHDV在实验感染鸭体内侵染规律的研究 2．1 DSHDV实验感染鸭临床病理学发展规律 采用肌注、口服和滴鼻三种途径感染28日龄北京鸭。感染鸭发病症状：病鸭初期精神沉郁，不愿走动，随着病程的加剧，卧地不起，食欲减退，被毛凌乱，个别鸭流血泪，鼻腔流血性分泌物(90％)。并开始出现特征性症状：头部肿胀(100％)，眼结膜充血、出血呈红色，排灰白色或草绿色稀粪甚至血便。眼观病理变化：心冠脂肪有少量出血斑。头部颈部下黄色胶冻样水肿(80％)。胸腺出血严重，表面和切面有大小不等坏死点(70％)。肝脏呈橙黄色或土黄色，表面有大小不等的出血斑(85％)。心包有淡黄色积液(50％)。肾脏弥漫性出血。气管环状出血，滴鼻组多见(70％)。法氏囊严重出血。食道弥漫性出血形成条状出血带，口服组多见。泄殖腔黏膜初期有出血，后期坏死(50％)。脾肿大且呈深黑色，其上有白色坏死灶(50％)。 2．2 DSHDV在实验感染鸭体内侵染规律 2．2．1肌注组侵染规律经肌注感染90min后最早能从肾脏中检出病毒抗原；感染后6d仅不能从皮肤、脑、气管、哈德氏腺和腺胃中检测出抗原，该时间段也是病毒达到分布的高峰时期；从不同的时间的检测情况可以看出，经肌注感染病毒在鸭体内分布最为广泛的时间段为感染后12h～6d。 2．2．2口服组侵染规律 DS：HDV经口服途径感染初期肾脏、肠道、胸腺、法氏囊的阳性信号较强，而肺脏、心脏阳性信号弱。感染中期大多数组织都检测到了阳性信号，其中肾脏、肠道阳性信号有所增强，脾脏、肌肉、气管开始检测到阳性；哈德氏腺、脑、皮肤、腺胃在感染的整个过程都无阳性信号出现。 2．2．3滴鼻组侵染规律 DSHDV经滴鼻感染后4h最早能从肾脏肾小管上皮细胞浆中检出病毒抗原；感染后12h，能够从肝脏、肾脏、十二指肠和回肠中检出病毒抗原；感染后3d，仅不能从脑、腺胃、皮肤、哈德氏腺中检测出抗原。所以经过滴鼻途径感染DSHDV后24h～6d时间段是病毒达到分布的高峰时期；从不同的时间的检测情况可以看出，经滴鼻感染病毒在鸭体内分布最为广泛的时间段为感染后3d～6d。 综上所述，鸭胚是：DSHDV增殖的良好宿主平台，运用建立的IFA对人工感染DSHDV后石蜡切片与冰冻切片中病毒在鸭体内的分布规律进行研究表明：IFA检测28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭的心、肝、脾、胰、肺、肾、法氏囊、食管、气管、胸肌、胸腺、哈德氏腺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠为阳性；脑、皮肤、腺胃为阴性；阳性组织中病毒抗原主要分布在心脏心肌膜心肌纤维的肌浆中，肝脏肝小叶间的结缔组织和肝索区，胰腺外分泌部腺泡上皮细胞和腺泡心细胞的胞浆中，肾脏肾小管上皮细胞浆，法氏囊粘膜上皮细胞浆，食管黏膜肌层，十二指肠、空肠、直肠、回肠、盲肠肠绒毛上皮细胞浆、肠腺细胞浆中。肠道、肾脏、法氏囊和胸腺是DSHDV侵害的主要靶器官。

目录

文摘

英文文摘

声明

本论文的创新性研究工作

前言

1材料

1.1试验毒株

1.2参考毒(菌)株

1.3试验动物

1.4试剂及配制方法

1.5主要仪器设备

2方法

2.1不同接种途径的DSHDV在鸭胚中的繁殖规律

2.2兔抗DSHDV高免血清的制备及其IgG提取

2.3动物感染试验

2.4间接免疫荧光检测石蜡切片中DSHDV方法的建立与优化及DSHDV在鸭体内定植规律的研究

2.5间接免疫荧光检测冰冻切片中DSHDV方法的建立与优化及DSHDV在鸭体内定植规律的研究

3结果

3.1病毒在鸭胚中的培养特性

3.2兔抗DSHDV抗体的制备和纯化

3.3鸭人工感染DSHDV的临床症状及剖解变化

3.4间接免疫荧光检测石蜡切片中DSHDV方法的建立和优化

3.5间接免疫荧光检测冰冻切片中DSHDV方法的建立和优化

4讨论

4.1 DSHDV鸭胚培养特性及DSHDV人工感染鸭临床症状

4.2抗DSHDV抗体的制备与检测

4.3间接免疫荧光检测石蜡切片和冰冻切片中DSHDV方法的建立与优化

4.4不同感染途径DSHDV在鸭体内的分布规律

4.5间接免疫荧光检测石蜡切片与冰冻切片中DSHDV的比较和运用

4.6病毒在鸭体内侵染规律与病毒特性、致病机理的关系

5结论

6参考文献

附图1

附图2

图示说明

致谢

发表文章