鸭病毒性肿头出血症病毒感染特性及其免疫检测技术的研究

摘要

1998-2003年四川省、重庆市、贵州省和云南省等养鸭省份发生了一种以鸭头肿胀、眼结膜充血、出血，全身皮肤广泛性出血，肝肿胀呈土黄色，并伴有出血斑点，体温43℃以上，排草绿色稀粪等特征性的急性病毒性传染病。该病目前给养鸭业带来了巨大的经济损失。程安春等通过流行病学调查、临床症状和病理学变化观察、病理组织学检查、病原的分离鉴定、人工感染试验、电镜观察、防治试验，确诊为一种新的鸭病，并命名为“鸭病毒性肿头出血症(Duckviralswollenheadhemorrhagicdisease，DVSHD)”。国内其他学者也称之为“鸭传染性肿头症”或“鸭肿头败血症”。
　　 本病与鸭瘟在临床特征和尸检变化上有许多相似之处，鸭病毒性肿头出血症病毒(Duckswollenheadhemorrhagicdiseasevirus，DSHDV)是该病的病原。目前有关该病的研究资料报道较少，特别是有关DSHDV感染特性以及特异、敏感、快速的检测方法等更是缺乏深入研究。因此，本文对鸭病毒性肿头出血症病毒的对成年鸭和鸭胚感染特性以及相关的免疫检测技术进行了一系列的研究。
　　 本研究获得以下系列结果：
　　 1.鸭病毒性肿头出血症实验感染模型的建立：本实验用鸭病毒性肿头出血症病毒强毒（HY-99株）作为种毒，通过肌注、口服和滴鼻三种方式感染28日龄健康鸭，攻毒后每天观察临床症状和发病鸭及死亡鸭的剖检变化。结果显示，感染鸭出现以体温升高、头颈肿胀、眼结膜充血、出血、排灰白色或草绿色稀粪为主要特征的临床症状和肝脏肿大、出血呈土黄色、免疫器官和消化道严重充血、出血为主要特征剖检变化。结果表明，临床症状和剖检变化与自然感染鸭基本一致，本实验成功构建了鸭病毒性肿头出血症实验感染模型。感染鸭各个组织器官进行了动态组织病理学变化观察。结果表明，实验感染模型中三组鸭出现的组织病理学变化基本一致，但时间存在差异：肌注组鸭于感染后72h内、滴鼻组和口服组144h内组织病理学变化以充血、出血和炎性细胞浸润为主；肌注组鸭于感染72h后、滴鼻组和口服组144h后组织病理学变化以弥漫性出血、大小不等坏死灶或粘膜上皮细胞的坏死为主。免疫器官、消化腺、消化道、呼吸器官、心脏和肾脏等是主要的靶器官。这表明DSHDV是一种泛嗜性病毒，对全身各个组织器官具有严重破坏作用。
　　 3.DSHDV强毒在人工感染鸭宿主细胞内的形态发生学和超微病理学研究：电镜下，完整DSHDV粒子呈圆形或椭圆形，无囊膜，直径为70nm-85nm。病毒粒子仅出现在感染细胞的胞浆中。电镜下，可观察到病毒粒子于感染4h后吸附于法氏囊靶细胞表面，并通过细胞的内吞作用进入细胞后，在胞浆内脱去双层衣壳，随后在胞浆内复制并合成病毒相关蛋白。这些合成结构蛋白、非结构蛋白及成熟或不成熟的病毒粒子在胞浆内聚集成圆形、椭圆形或不规则形的包涵体结构。感染后24h-72h，病毒核酸在这些基质上组装和成熟形成完整的病毒粒子。感染144h后，成熟病毒通过细胞的崩解而释放到细胞间隙。DSHDV强毒人工感染成年鸭后能够引起宿主细胞明显的超微结构变化（坏死和凋亡）。该病毒的主要靶器官包括法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏、消化道和肾脏等器官。病毒侵染靶细胞主要有：淋巴细胞、肝细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、上皮性网状细胞、粘膜上皮细胞、肠腺细胞等。
　　 4.DSHDV强毒致人工感染鸭和鸭胚宿主细胞凋亡的研究：通过TEM法观察发现，DSHDV经尿囊腔感染10日龄鸭胚后尿囊膜上皮细胞、肝细胞、肠道上皮细胞和心肌细胞发生凋亡。凋亡细胞时间分布在感染后24h-96h，同时在部分宿主细胞的胞浆内发现少量病毒粒子。本研究利用HE染色法、TEM法和TUNEL法三种方法均观察到DSHDV感染诱导鸭宿主细胞的凋亡。发生凋亡的器官包括法氏囊、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、心脏、食管、腺胃和肠道。宿主细胞的凋亡指数从感染后2h到72h逐渐增加，72h达到最高值。感染72h后，濒死鸭和死亡鸭宿主细胞死亡以典型坏死为主。DSHDV感染诱导的细胞凋亡在DVSHD的致病机制中起到重要作用。
　　 5.免疫酶组织化学检测DSHDV抗原方法的建立和应用：本研究以兔抗DSHDVIgG作为一抗、HRP-羊抗兔IgG作为二抗建立并优化了在石蜡切片中检测DSHDV抗原的间接免疫酶SP法，研究证实本方法具有较高的特异性和敏感性。该方法的应用研究揭示，三组鸭感染DSHDV后，肌注组(4h)、滴鼻组(12h)和口服组(24h)依次首先从法氏囊组织中检测阳性信号，随后抗原在多个组织中检出，包括免疫器官、消化腺、消化道、肾脏、心脏、肺脏和气管等。DSHDV侵染的靶细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、网状细胞、粘膜上皮细胞、肝细胞、间质细胞、腺泡细胞、肠腺细胞、肾小管上皮细胞、心肌细胞和柱状上皮细胞等。
　　 6.间接ELISA检测鸭病毒性肿头出血症抗体方法的建立和应用：本研究以浓缩纯化的DSHDV作为包被抗原，建立了检测DSHDV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。试验最佳反应条件为：抗原最佳稀释度为1：40，高免血清为1：80稀释，最佳反应时间为60min；酶标抗体为1：2000稀释，最佳反应时间为60min；封闭液为1％BSA-PBST，封闭时间为60min；包被抗原最佳工作条件为37℃孵育1h后过夜；底物的最佳反应时间为37℃孵育15min。本实验建立的方法可成功应用于临床样品的检测和鸭免疫后抗体水平的评估。因此，本方法具有良好的特异性、稳定性、可重复性和较高的敏感性，可用于DVSHD抗体的检测。

目录

文摘

英文文摘

本论文的创新性工作

常用缩略词表

第一部分 文献综述

第一章 鸭主要病毒性传染病病原的感染特性

1 概况

2 鸭病毒性传染病流行特点

3 鸭主要病毒性传染病病原的感染特性

4 存在的问题和研究方向

第二章 免疫酶技术在病毒病研究中的应用

1 免疫酶技术基本原理

2 免疫酶技术发展简史

3 酶标技术的研究进展

4 免疫酶技术的研究就进展

5 免疫酶组化在病毒病研究中的应用

6 酶联免疫吸附测定法在病毒病研究中的应用

第二部分 实验研究

第三章 DSHDV强毒人工感染鸭实验模型构建及组织病理学发展规律研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

Studies on histopathological changs of ducks experimntally infeeted with virulent DSHDV(strain HY-99)

第四章 DSHDV强毒在人工感染鸭宿主细胞内的形态发生学和超微病理学研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

Morphogenesis and ultrastrural pathology in experimentally infectd ducks with virulent DSHDV

第五章 DSHDV强毒人工感染鸭和鸭胚致宿主细胞凋亡研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

Study on host cll apoptosis induced by virulent DSHDV infection in vivo.

第六章 免疫组化检测DSHDV方法的建立和在检测病毒侵染规律研究中的应用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

Development and application of an indirect immunoperoxidase assay for the detection of DSHDV against in tissnes

第七章 间接ELISA检测鸭病毒性肿头出血症抗体方法的建立和应用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

Development and application of an indirect ELISA for the detection of antibodies against DSHDV

第三部分 结论

第四部分 参考文献

第五部分 致谢

攻读学位期间发表的学术论文