戊糖乳杆菌C50-6细菌素的纯化和特性研究

摘要

为了获取广谱、高效的乳酸菌细菌素产生菌，本文对分离自四川传统发酵肉制品(香肠、腊肉)中的91株乳酸菌，以大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)10209、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为指示菌，采用打孔法初筛，进一步通过排除有机酸、过氧化氢干扰及发酵液的蛋白酶降解实验复筛，得到1株产广谱(能抑制G+菌和G-菌)细菌素的菌株C50-6，经表型特征和16SrDNA系统发育特征鉴定为戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)。 采用单因素实验，对戊糖乳杆菌C50-6产细菌素的培养时间、温度、起始pH条件进行优化，结果表明：将菌株C50-6种子液按2％接种量接入起始pH6.0的MRS肉汤，经30℃培养36h能获得较高的细菌素产量，其发酵液效价可达1151IU/ml，是原培养条件细菌素产量的3.6倍。 分别采用硫酸铵盐析、有机溶剂沉淀、正丙醇提取、pH吸附几种方法对戊糖乳杆菌C50-6细菌素进行粗分级分离，综合分析后选取效果最好的硫酸铵盐析法。该细菌素的纯化步骤依次为：首先取发酵液离心得去菌体细胞的上清液，再向其中加入硫酸铵固体粉末至饱和度70％，静置过夜，离心取沉淀溶于pH4.5的柠檬酸缓冲液得到细菌素粗提液，用相同的缓冲液进行过夜透析脱盐，再经过SP-Toyopeal-650M阳离子交换色谱纯化，采用含0.1mol/LNaCl的pH4.4的柠檬酸缓冲液洗脱可得细菌素的活性峰，最终细菌素比活提高了39倍，得率为21.8％。经Tricine-SDS-PAGE检测该细菌素的分子量约为2500Da，抑菌实验表明该蛋白条带具有很强的抑菌活性，证实该电泳条带即是细菌素。 对细菌素的发酵液和粗提液的特性进行对比研究，发现发酵液在pH2.0-5.0、粗提液在pH2.0-6.0时显示活性；发酵液100℃耐受20min，粗提液具有更高的热稳定性，121℃加热20min后活性无损失；发酵液和粗提液都被木瓜蛋白酶和胰蛋白酶失活，被蛋白酶K部分失活，不被胃蛋白酶失活；发酵液和粗提液具有较一致的抑菌谱，二者均能有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等G+和G-细菌、能抑制戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)G21-10和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)C21-6等近源乳酸菌、对红酵母(Rhodotorulasp.)和青霉(Penicilliumsp.)也有微弱的抑制作用，细菌素粗提液的效价明显提高，经过排除有机酸干扰后粗提液对G+菌抑制作用更为显著。总之，戊糖乳杆菌C50-6所产细菌素在酸性和中性环境下稳定、对热稳定、能被部分蛋白酶失活、抑菌谱较广，具有作为食品生物防腐剂的潜在应用价值。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1文献综述

1.1.1乳酸菌细菌素定义及分类

1.1.2细菌素活性检测及其产生菌的筛选

1.1.3细菌素的发酵条件

1.1.4细菌素的纯化

1.1.5细菌素的生物合成和表达

1.1.6细菌素的作用机理

1.1.7乳酸菌细菌素在食品中的应用

1.2研究目的和意义

1.3研究内容和方法

1.3.1产生菌的筛选和鉴定

1.3.2细菌素培养条件的优化

1.3.3细菌素的纯化

1.3.4细菌素的特性研究

第二章产细菌素乳酸菌的筛选与鉴定

2.1材料

2.2方法

2.2.1菌株的筛选

2.2.2菌株的确定

2.2.3产细菌素菌株C50-6的鉴定

2.3结果与分析

2.3.1菌株初筛结果

2.3.2菌株复筛结果

2.3.3菌株C50-6鉴定结果

2.4讨论

2.5小结

第三章细菌素的培养条件优化及纯化

3.1材料

3.2方法

3.2.1抑菌实验方法

3.2.2细菌素效价分析

3.2.3细菌素培养条件优化

3.2.4蛋白质浓度测定方法

3.2.5细菌素的粗分级分离

3.2.6细菌素的纯化

3.2.7细菌素分子量的测定

3.3结果与分析

3.3.1 nisin效价标准曲线

3.3.2最佳培养条件的确定

3.3.3 BSA蛋白质浓度标准曲线

3.3.4细菌素粗提方法的确定

3.3.5阳离子交换色谱

3.3.6细菌素纯化效果

3.3.7 Tricine-SDS-PAGE估测细菌素分子量

3.4讨论

3.5小结

第四章细菌素生物学特性的研究

4.1材料

4.2方法

4.2.1细菌素的理化特性实验方法

4.2.2细菌素的抑菌谱测定

4.3结果与分析

4.3.1细菌素的pH稳定性

4.3.2细菌素的热稳定性

4.3.3细菌素的蛋白酶敏感性

4.3.4细菌素的抑菌谱

4.4讨论

4.5小结

第五章全文结论

第六章问题及展望

参考文献

致谢

附录

攻读硕士期间发表的学术论文