产柚苷酶高产菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究

摘要

利用脱苦酶实现蜜柚的脱苦，对营养成分无破坏，不影响或改变柚汁或蜜柚果酒的天然良好风味，是最理想和最具产业化应用前景的方法，也是目前该领域的研究热点。本课题以自然界得到的菌株为出发菌株，对脱苦酶中最主要的一种酶一柚苷酶的高产菌株筛选、菌种鉴定，发酵产酶的周期规律，酶活力检测方法的比较以及粗酶的基本性质进行了研究。 本文首先对由本实验室从发霉的蜜柚果皮、腐烂柚果堆积处的土壤处分离筛选得到的共60株真菌菌株进行了筛选。柚苷酶是一种诱导酶，含柚皮苷粉或苦味物丙酮提取液的培养基是该菌株的最佳诱导产酶培养基。采用透明圈法和平板划线法对菌株进行了初步的纯化分离，将所分离得到的纯菌株接种于以0.5％柚皮苷粉为产酶诱导物的选择性固体平板培养基上，28℃培养5d，通过观察其生长情况对菌株进行初筛；将初筛菌株接种到以0.5％柚皮苷粉为产酶诱导物的液体发酵培养基中，28℃、160rmp摇床培养5d，经台式中型低温离心机离心(3500rpm，15min)后取粗酶液，用Dayis法测定酶活，筛选出一株实验室编号为P-61的菌株所产酶的酶活最高，为310.64，于是决定以该菌株做为后续研究的目标菌株。通过对该菌株的有性观察、外观观察和显微镜观察得出结论：有性孢子不详或不发生，鉴定编号为P-61菌种为有性世代还未被发现的半知菌类(FungiImperfeeti)。分生孢子穗球形，紫褐色至黑色，与丛梗孢科(Moniliaceae)，单孢亚科(AmerosporoideaeofMoniliaceae)，曲霉族(Aspergilleael)，曲霉属(AspergillusMich.exFr.)，黑曲霉组(A.niger)的描述基本上相吻合，因此，鉴定为此株菌为黑曲霉。 本实验对黑曲霉P-61的发酵产酶规律进行了研究，对比了利用紫外分光光度计测定柚苷酶酶活性的Dayis法和高效液相色谱法的优劣之处，在相同的发酵产酶培养条件下，通过对柚苷酶的发酵产酶培养基中还原糖含量、柚皮苷含量、柚苷素含量和柚苷酶酶活随培养时间增加而变化的趋势观察，得出结论：以柚皮苷溶液浓度1.5g/L为为菌体生长诱导底物的液体发酵培养基的产酶情况最为稳定；用Dayis法测定酶活速度快，但可能受到柚皮苷降解的中间产物的干扰，准确度较差，用高效液相色谱法测定酶活性，虽然前处理和开机操作比较烦琐，但测定结果的准确度较高，受到的干扰小。 最后，本实验对28℃、160rpm摇床培养5d后的培养液，于4℃，用冷冻离心机经5000×g离心15min得到的粗酶液的酶学性质进行了基础性的研究。确定采用二次沉淀法，先用30％的硫酸铵沉淀除去杂蛋白，再用60％硫酸铵沉淀盐析出柚苷酶。经过SDS-PAGE，确定了P-61菌株所产粗酶液5倍超滤浓缩后的分子量，约为100KDa。酶活性及稳定性随环境而变化，在pH4.0和温度为50℃时，酶的活性最高；溶液的离子种类对此黑曲霉P-61所产的酶活性有一定影响，Ca2+(5mol/L)对此粗酶有相对较强的激活作用，Zn2+、K+、EDTA对酶有很强的抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1蜜柚脱苦酶概述

1.1蜜柚中的苦味物质

1.2蜜柚果汁酶法脱苦的特点

1.3蜜柚脱苦酶的研究现状

2用于降解柠檬苦素类化合物的酶

2.1柠檬苦素类化合物的基本性质

2.2酶的来源

2.3酶对柠檬苦素类化合物的降解机制

2.4柠檬苦素类脱苦酶对果汁中苦味物质的作用

3柚皮苷与柚皮苷酶的概况

3.1柚皮苷的概况

3.2柚皮苷酶体系及酶的来源

3.3柚皮苷酶的降解机制

3.4柚苷酶活力的检测方法

3.5柚苷酶的分离纯化研究现状

3.6固定化柚苷酶的研究现状

4本研究的意义和内容

4.1选题意义

4.2研究内容

第二章产柚皮苷酶高产菌株的分离、筛选与鉴定

1引言

2材料与方法

2.1主要仪器

2.2主要试剂

2.3实验方法

3结果与分析

3.1产柚苷酶菌株的筛选

3.2紫外扫描波长的确定

3.3产柚苷酶菌株的酶活测定结果

3.4对实验室编号P-61菌种的鉴定结果

4讨论与结论

第三章黑曲霉P-61菌株的产酶规律的研究

1引言

2材料与方法

2.1主要仪器

2.2主要试剂

2.3实验方法

3结果与分析

4讨论与小结

第四章柚苷酶的初步纯化和酶活性的研究

1引言

2材料与方法

2.1主要仪器

2.2主要试剂

2.3实验方法

3结果与分析

3.1分级盐析

3.2酶的纯度的鉴定

3.3离子交换层析结果

3.4温度对粗酶活性的影响

3.5 pH值对粗酶活性的影响

3.6金属离子及鳌合剂对粗酶活性的影响

4讨论

参考文献

致 谢

攻读硕士学位期间公开发表论文情况