携带TGEVS和PEDVS双基因的减毒沙门氏菌在猪体的免疫动态规律

摘要

猪流行性腹泻病毒(PEDV)与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均属冠状病毒属，引起猪的高度接触性肠道传染病，给养殖业造成了重大经济损失，且目前没有有效的药物预防，疫苗是防控这两种病的最佳选择。本实验室前期已构建了携带TGEV S和PEDV S的双基因疫苗SL7207(pVAXD-PS1-TS)和单基因疫苗SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)，并在小鼠模型上进行了SL7207(pVAXD-PS1-TS)的免疫评价。为了进一步了解SL7207(pVAXD-PS1-TS)在猪体的免疫原性与动态规律，我们将该双基因口服疫苗在猪体进行了免疫评价，对体液免疫、粘膜免疫、细胞因子、中和试验等进行了全面的评价，为科学评价该疫苗提供依据，为后续研究提供参考。
　　将保存的疫苗菌株SL7207（pVAXD-PS1-TS）、SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)复苏培养，抽提质粒对目的基因进行PCR和酶切鉴定，结果证实携带质粒的准确性，然后将菌株扩大培养制备口服疫苗。将15头仔猪随机分成5组，双基因免疫组SL7207(pVAXD-PS1-TS)、单基因对照组SL7207(pVAXD-PS1)和L7207(pVAXD-TS)、空载体对照组SL7207(pVAXD)、含5％NaHCO3的PBS。将重组沙门氏菌以1.6×1011CFU的剂量分别口服接种3只仔猪，每头猪口服10mL，两周后以2.0×1011CFU的免疫剂量加强免疫，免疫后无临床可见病变。分别在首次免疫后第0、2、4、6、8w采集仔猪血液和粪黏液样品，以ELISA检测血清IgG、γ-干扰素、IL-4、粪便黏膜IgA抗体的动态水平，以中和试验测定抗体中和效价，以MTT法检测外周血淋巴细胞增殖情况。
　　体液免疫和黏膜免疫结果显示:免疫组SL7207（pVAXD-PS1-TS）对照组SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)均可诱导机体产生特异性的血清IgG抗体及粪黏液IgA抗体，SL7207(pVAXD-PS1-TS)能同时诱导针对TGEV和PEDV的特异性抗体。首免后第2w，免疫组SL7207(pVAXD-PS1-TS)和对照组SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)特异性抗体开始增加，第4周均可检测到特异性IgG、 IgA抗体;第6w抗体水平均达到最高峰，第8w抗体水平开始下降。中和实验结果显示，SL7207(pVAXD-PS1-TS)、SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)均可诱导中和抗体产生，其中SL7207(pVAXD-PS1-TS)组的PEDV中和效价10-1.57(1∶37.17)略低于SL7207(pVAXD-PS1)中抗PEDV中和效价可达10-1.7(1∶50.25); SL7207(pVAXD-PS1-TS)中诱导的抗TGEV中和效价10-1.5(1∶31.64)略低于SL7207(pVAXD-TS)诱导的抗TGEV中和抗体效价10-1.58(1∶38.02)。
　　细胞免疫结果显示:免疫组SL7207（pVAXD-PS1-TS）对照组SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)仔猪血清中都能检测到IFN-γ和IL-4。第6周达到最高峰，且SL7207(pVAXD-TS-PS1)、SL7207（pVAXD-TS）、SL7207（pVAXD-PS1）组诱导产生的IFN-γ、 IL-4含量与SL7207(pVAXD)和PBS之间存在极显著差异(P＜0.01);SL7207(pVAXD-PS1-TS)诱导产生的IFN-γ、IL-4含量与SL7207(pVAXD-PS1)相比，具有显著差异(P＜0.05)。外周血T淋巴细胞的增殖结果显示:菌株SL7207(pVAXD-PS1-TS)、SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pV XD-TS)均可促进外周血T淋巴细胞的增殖。首免后第2w，外周血T淋巴细胞的增殖作用开始增强;第6w，外周血T淋巴细胞的增殖作用均达到最高峰，与对照组SL7207(pVAXD)、PBS间存在极显著差异(P＜0.01)。且SL7207(pVAXD-PS1-TS)的增殖作用大于SL7207(pVAXD-PS1)、SL7207(pVAXD-TS)。因此，SL7207(pVAXD-PS1-TS)在增强宿主特异性细胞免疫方面比单基因疫苗更具优势。
　　综上所述，口服疫苗SL7207(pVAXD-PS1-TS)在猪体具有良好的免疫原性，能够诱导全面的免疫反应包括体液、黏膜、细胞免疫。该疫苗的优势主要体现在它可以同时诱导针对TGEV和PEDV的免疫反应，而且SL7207(pVAXD-PS1-TS)在增强宿主特异性细胞免疫方面比单基因疫苗更具优势。

目录

论文说明

声明

摘要

英文缩略词

第一章 文献综述

1 流行性腹泻概述

1．1 病原学

1．2 基因及其编码蛋白

1．3 PED传统疫苗

1．4 基因工程疫苗

2 猪传染性胃肠炎概述

2．1 TGEV的病原学特征

2．2 TGEV结构蛋白与功能

2．3 猪传染性胃肠炎重组活载体疫苗

3 减毒沙门氏菌作为疫苗载体的研究

3．1 关于减毒沙门氏菌的减毒

3．2 关于减毒沙门氏菌作为黏膜免疫载体的应用

3．3 减毒沙门氏菌作为疫苗载体存在问题

4 黏膜免疫

4．1 黏膜免疫系统

4．2 黏膜免疫的应用

4．3 口服免疫

4．4 黏膜免疫存在的问题

5 本研究的目的意义

第二章 研究部分

1 材料

1．1 菌株及实验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 疫苗菌株的鉴定

2．2 仔猪免疫实验

3 结果

3．1 重组质粒鉴定

3．2 重组菌株口服免疫结果

4 讨论

4．1 重组减毒沙门氏菌疫苗口服免疫原性分析

4．2 影响DNA疫苗免疫效果的因素

4．3 关于TGEV和PEDV的双基因疫苗

4．4 小鼠模型在疫苗研究中的应用

4．5 存在问题

5 结论

参考文献

致谢