PEDV/TGEV/PDCoV快速检测方法的建立及PEDV COE基因和ORF3基因遗传变异研究

摘要

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）和猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis，TGE）分别是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Coronavirus，TGEV）引起的一种急性、高度接触性肠道疾病。各个年龄段的猪均可以感染发病，尤其以一周龄以内的仔猪为主。猪丁型冠状病毒又称猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是在美国PEDV暴发时期新发现的一种猪腹泻病原，2013年至今，在猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎广泛存在放的情况下，PDCoV也随之出现。这三种病的临床发病情况基本相似，均使发病猪呈现呕吐和水样腹泻症状，一般的临床症状较难鉴别。
　　为了快速鉴别诊断猪丁型冠状病毒、猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎的流行和混合感染的情况，建立了一套能快速、准确检测PEDV、TGEV和PDCoV三重RT-PCR检测方法。为了提高对PEDV检测的准确性和灵敏性，避免实验过程中假阳性的出现，建立了一套巢式 RT-PCR检测方法，可用于较低浓度模板的PEDV的检测。试验还对我国20株PEDV流行株的ORF3基因和COE基因分别进行了遗传变异分析。
　　根据冠状病毒保守序列 N基因设计筛选出特异性高的三对引物，再进行各种试验对不同反应条件和体系进行优化，确定 PEDV、TGEV浓度为0.24μM，PDCoV浓度为0.32μM；10×PCR缓冲液为1 mM，Taq DNA聚合酶终浓度为2.5U，dNTP终浓度0.2 mmol/L；退火温度为56℃。用上述方法对PRRSV、CSFV、RV、PPV进行扩增，结果为阴性；多重RT-PCR检出PEDV、TGEV、PDCoV的最低含量分别为33.4pg、28.56pg、322.3pg。该方法敏感性和特异性较好，为今后各个地区腹泻病原的快速准确的鉴别诊断提供一个很好的方法。利用建立的三重RT-PCR方法和单重RT-PCR分别对149份临床样品进行检测，所有检测样品中PEDV阳性率是46.3％，PDCoV阳性率是1.4%，TGEV和混合感染在本次检查中未检出，且与单重RT-PCR的检测结果一致。
　　由于PEDV在模板含量较低时，用常规RT-PCR难以得到满意的结果，本试验还建立了一套巢式RT-PCR。经过特异性与灵敏性试验，发现该方法对猪的其他病毒的扩增为阴性；用常规 RT-PCR能检测出284pg/μL；而巢式 RT-PCR可以检测出2.84pg/μL，结果显示它提高了反应敏感性。
　　本试验对20株PEDV的ORF3基因和COE片段进行了系统的遗传变异分析。比较分析发现其核苷酸同源性95.5%~100%；氨基酸同源性为84.9%~100%（除JXNC和GDZH）；核苷酸和氨基酸与中国其他毒株存在相似的突变；ORF3基因进化树分析显示，20株PEDV流行毒株均在G2分支上，与经典毒株CV777亲缘关系较远，与中国其他毒株亲缘关系密切。PEDV ORF3基因的特征可用于区分强弱毒，在ORF3基因第245~295位置处没有49~51bp的缺失，说明这20株流行株属于强毒株。PEDV的S基因的抗原表位域（COE基因）分析显示其核苷酸同源性95.8%~100%，氨基酸同源性为95.1%~100%；核苷酸和氨基酸分别有11个和5个共同突变位点；COE基因遗传分析显示，有两株（JXTJ、JXBS）在G1分支上，其余18株均在G2上，和中国前几年流行株与 DR13强毒株属一个分支，与经典毒株CV777亲缘关系较远，表明大部分PEDV中国流行株的COE基因在不同程度的变异使其抗原性发生了改变，较好地解释了免疫过PEDV疫苗的猪群仍感染和爆发PED。开展以COE基因和ORF3基因的分析，可以更好的了解流行株的遗传变异情况，有助于PEDV的快速诊断和防控。

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第一章 前言

1.1 流行病学

1.2 猪流行性腹泻病毒感染研究概况

1.2.1 猪流行性腹泻及其分子生物学特性

1.3 猪流行性腹泻病毒检测方法研究进展

1.3.1 免疫电镜法

1.3.2 免疫荧光法

1.3.3 微量血清中和试验

1.3.4 ELISA方法

1.3.5 RT-LAMP技术

1.3.6 RT-PCR检测法

1.4 本研究的目的和意义

第二章 PEDV、TGEV、PDCoV三重RT-PCR检测方法的建立

1 材料与方法

1.1 病毒和毒株

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 常用试剂和培养基配制

1.5 引物的设计与合成

1.6 样品及模板的制备

1.7 常规RT-PCR扩增

1.8 多重PCR检测方法的建立及条件优化

2 结果

2.1 单重PCR条件的确定

2.2 多重PCR条件的摸索

2.3 多重RT-PCR特异性检测结果

2.4 多重RT-PCR敏感性检测结果

2.5 多重RT-PCR临床检测和单重RT-PCR的比较结果

3 小结与讨论

第三章 猪流性腹泻病毒套式RT-PCR检测方法的建立

1 材料与方法

1.1 毒株及细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 常用试剂和培养基配制

1.5 引物的设计与合成

1.6 RNA的抽提与cDNA的合成

1.7 操作方法

1.8 特异性试验

1.9 灵敏性试验

1.10 RT-nested PCR的初步应用

2 结果

2.1 套式RT-PCR的结果

2. 2特异性检验

2.3 灵敏性试验

2.4 RT-nested PCR的初步应用结果

3 讨论与小结

第四章 猪流行性腹泻病毒ORF3和COE全基因序列测定及分析

1 材料与方法

1.1 病毒

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

1.4 常用试剂和培养基配制

1.5 引物的设计与合成

1.6 参考毒株

1.7 病料的鉴定

2 结果

2.1PEDV ORF3和COE全基因RT-PCR扩增结果

2.2 菌液PCR检测和序列分析结果

3 讨论与小结

全 文 总 结

致谢

参考文献