2013年安徽PEDV毒株的分离鉴定及其ORF3、M和N基因的遗传变异分析

摘要

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引发猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）。该病急性接触传染病，主要症状是仔猪黄色水样腹泻、呕吐和脱水。PEDV毒株的ORF3基因负责编码一种离子通道蛋白，与病毒毒性大小有重要关系；M基因负责编码一种跨膜蛋白，对病毒的组装和出芽有重要意义；N基因负责编码核衣壳蛋白，对形成核衣壳具有重要作用。为了解安徽省PEDV的流行和遗传进化情况，作者收集2013年2月-2013年4月爆发PED猪场病死仔猪的十二指肠、空肠、肠系膜淋巴结等作为样品进行PEDV的分离和鉴定，以本实验室保存的PEDV阳性病料作为阳性对照，分离鉴定出6株PEDV毒株后，对其ORF3基因、M基因、N基因进行遗传进化分析。
　　作者采用Trizol法提取RNA，TAKARA公司反转录试剂盒转录CDNA并于-20℃保存备用。用Oligo7.0参考CV777标准毒株（AF353511.1）序列设计本研究所需的特异性引物。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统下观察或拍照。样品病料PCR检测，设计的特异性引物覆盖M基因全段，片段大小为412bp，电泳条带与阳性对照的大小相当，阴性对照未出现任何条带，确定6个地方的病料中存在PEDV毒株。Vero细胞培养至50代后，将过滤除菌后病料溶液接种到Vero细胞，第22代细胞在48h出现肉眼可见CEP。41代时接毒细胞发生规律性病变，且每次时间在缩短：细胞在24h就出现细胞肿胀、破裂、脱落；36h后细胞开始大量脱落，细胞间隙比之前增大；48h后细胞脱落达90％，细胞呈梭形，互相之间拉伸成网状；而阴性对照细胞病变速度缓慢、病变率较小。
　　此后用SYBR Green I实时荧光定量PCR和传统PCR对分离的PEDV毒株进行鉴定，特异性引物针对M基因，片段大小为299bp。所建PEDV标准曲线符合实验预测效果并且具有良好线性关系：相关系数为0.999，扩增效率为1.03；敏感性试验中检测到的最低的质粒浓度是12.1 copies/μL，是常规PCR检测到的数值的100倍。重复性试验Ct值的变异系数是0.12%-0.56%，组间变异系数是0.65%-2.33%，表明这个实验具有良好的稳定性和重复性。将得到的 PCR产物回收纯化后送出测序，进行序列分析发现与PEDV M基因的同源性为99.9%，确认分离的6株毒株为PEDV，并分别命名为AH1301、AH1302、AH1303、AH1304、AH1305、AH1306。
　　6株PEDV分离株的ORF3、M、N基因的PCR检测所设计的特异性引物均覆盖ORF3、M、N基因，片段大小分别为705bp、715bp、1442bp；PCR产物回收后分别连接 pMD18-T上进行转化和克隆，得到阳性重组质粒送出测序。序列分析显示：6个安徽PEDV毒株的ORF3全长675bp，编码224个氨基酸；6个M全长681bp，编码226个氨基酸；6个N全长1326bp，编码441个氨基酸。6个毒株ORF3蛋白均比attenuated DR13弱毒株多17个氨基酸。与CV777标准株相比，有2个ORF3分别出现了1个新变异氨基酸；6个M基因除AH1304外均在第13氨基酸位点出现E→Q突变；6个N的核苷酸与氨基酸均未出现片段的增多或者缺失的现象。同源性分析显示：ORF3、M、N基因与参考毒株的核苷酸序列同源性分别为98.8%-100%、97.5%-100%、96.2%-99.7%；氨基酸同源性分别为99.6%-100%、97.8%-100%、97.3%-100%。遗传进化树表明：6个毒株的ORF3基因、M基因和N基因与参考毒株均可分成3个群：其中AH1304株与弱毒株SD-M和attenuanted DR13亲缘性最近，剩下的5株安徽毒株与2013年美国流行毒株IA1和2012年中国流行毒株AH2012亲缘关系更近；6株PEDV毒株均与CV777标准毒株、中国LZC毒株亲缘关系较远。

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缩略语表（Abbreviation）

文献综述

1 猪流行性腹泻概述

2 实时荧光定量PCR技术

3 预防与治疗

4 研究的目的和意义

引言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果及分析

2.1 PEDV感染样品的鉴定

2.2 病毒的培养

2.3 分离毒株的鉴定

2.4 ORF3基因、M基因、N基因的扩增

2.5 质粒的鉴定、测序及序列拼接

2.6 ORF3基因、M基因和N基因的分析

3 讨论

3.1 PEDV在细胞上的培养

3.2 SYBR Green I 实时荧光定量PCR实验

3.3 ORF3基因的序列分析及遗传进化树分析

3.4 M基因的序列分析及遗传进化树分析

3.5 N基因的序列分析及遗传进化树分析

4 结论

参考文献

附录A6株毒株的同源性分析

附录B 6株毒株ORF3、M、N基因的核苷酸序列

附录C6株毒株M基因的氨基酸序列

致谢

作者简介

硕士期间发表文章