抗鸭瘟病毒活性物质的筛选及白藜芦醇抗鸭瘟病毒活性与作用机制研究

摘要

疱疹病毒临床治疗药物以核苷酸类似物为主。该类药物作用靶点类似，容易导致交叉耐药性，目前临床已有耐药毒株出现。因此，发现新的靶点药物是未来研究疱疹病毒药物的重点。鸭瘟病毒(Duck Plague Virus，DPV)是一种急性传染性病毒，该病毒属疱疹病毒科。目前，没有针对DPV的治疗药物出现，生产上以注射疫苗预防为主。本研究拟从天然药用产物中筛选出具有抗DPV活性的物质，并对该物质抗病毒机制进行研究，希望能找到新的作用靶点，为鸭瘟的治疗提供新的方法，也为抗疱疹类病毒药物的开发提供新的靶点和思路。本研究分为以下几个部分:
　　1、体外抗DPV活性物质筛选选取多种天然药用产物，运用细胞病变法和噻唑蓝比色法相结合的方法，进行体外抗DPV研究。结果如下:①传统中药粗提物中，虎杖和茜草的醇提物具有一定的抗DPV活性:虎杖醇提物对DPV最高抑制率为76.5％;茜草醇提物对DPV最高抑制率为48.91％。②印楝种仁醇提物石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水层分对DPV的最高抑制率分别为13.23％、29.24％和11.72％。③油樟挥发油及其主要活性成分中，松油烯-4-醇、α-松油烯、γ-松油烯和1，8-桉叶素对DPV抑制率分别为4.42％、14.27％、25.33％和21.02％。由以上结果可知，所检测的多种天然药用产物中，虎杖醇提物抗DPV效果最好。
　　2、白藜芦醇体外抗DPV活性研究以虎杖中主要药用成分白藜芦醇作为研究对象，通过CPE、MTT法和滴度法检测了白藜芦醇体外抗DPV活性。结果如下:①利用CPE法观察白藜芦醇对DPV引起的鸭胚成纤维细胞（Duck embryo fibroblasts，DEFs）病变的抑制作用。结果发现，当白藜芦醇浓度为31.25μg/mL，能够完全抑制细胞病变。②利用MTT法检测白藜芦醇对DPV的抑制作用。结果发现，白藜芦醇体外抗DPV的半数抑制浓度为3.85±0.08μg/mL，半数有毒浓度为61.07±0.24μg/mL，治疗指数为15.86。③通过滴度法检测白藜芦醇作用后DEFs中繁殖的DPV的滴度。结果发现,白藜芦醇能够显著降低病毒在细胞内增殖后的滴度。由以上结果可知，白藜芦醇具有良好的体外抗DPV活性。
　　3、TaqMan绝对荧光定量PCR方法的建立和白藜芦醇对DPV体外复制的影响以DPVUL30基因为目标片段，设计引物和TaqMan探针，建立荧光定量PCR方法，结果表明，该方法建立的标准曲线线性关系良好(R2=0.997)，扩增效率(E)为99.7％，且具有良好的特异性、敏感性和稳定性。利用该方法检测白藜芦醇对DPV在DEFs中的生长影响，结果如下:①病毒感染组:病毒粒子在感染DEFs8h时开始逐渐增多，到48h达到最高点。②白藜芦醇作用组:病毒粒子拷贝数24h内无明显增多，24h后病毒粒子拷贝数开始增长，增长速度显著低于病毒感染组(p＜0.05)。以上结果表明，白藜芦醇能够延长DPV在DEFs中的潜伏期，对该病毒在宿主细胞中的复制有明显的抑制作用。
　　4、白藜芦醇体外抗DPV作用特征的研究通过不同方式用药、不同时间加药以及透射电镜等方法研究白藜芦醇体外抗DPV作用特征。结果如下:①以胞外直接杀灭、药物对细胞的保护、病毒穿入和病毒胞内繁殖四种方式，考察白藜芦醇体外抗DPV活性。利用已建立的TaqMan荧光定量PCR方法检测各方式下病毒繁殖后的拷贝数，结果发现:白藜芦醇通过影响病毒在胞内的繁殖发挥作用。②利用滴度法检测在病毒进入细胞后第0h，2h，4h，6h，8h加入白藜芦醇情况下病毒滴度变化情况，结果发现，各时间点加药组病毒滴度均低于病毒感染组;各用药组中，第0-6h加药组病毒滴度显著低于第8h加药组(p＜0.01)。结果表明，白藜芦醇主要是在病毒进入细胞后的前8h发挥抗病毒作用的。③通过透射电镜揭示病毒进入细胞后在宿主细胞内的复制过程，并对白藜芦醇作用下的染毒细胞进行观察。结果发现，白藜芦醇作用下的DPV在DEFs细胞核内的病毒核酸复制和核衣壳的形成受到阻碍。由以上结果可知，白藜芦醇主要是在作用于DPV感染宿主细胞后的前8h内发挥抗病毒活性，在该阶段，病毒主要在宿主细胞核内进行病毒核酸的复制和相关蛋白的表达。
　　5、白藜芦醇对DPV立即早期和早期基因转录的抑制作用研究本研究建立了SYBRGreenⅠ反转录荧光定量PCR方法，以β-actin作为内参，研究了白藜芦醇对UL2，UL23，UL30，UL39，UL40，IRS和TRS等立即早期和早期基因的转录抑制作用。结果发现，不同浓度的白藜芦醇对所检测的基因转录均有明显的抑制效果，白藜芦醇浓度越高，基因的转录水平越低。当白藜芦醇浓度为31.25μg/mL时，被检测的所有基因24h内无明显转录发生。结果表明，高浓度白藜芦醇能够明显抑制上述基因的转录水平。由于上述基因属于病毒DNA复制必需基因，它们的转录产物直接参与病毒核酸的复制过程，其中IRS、TRS和UL23作为病毒立即早期荩因，在早期基因的转录中也发挥重要的作用。因此，白藜芦醇对立即早期基因的抑制作用可能是导致DPV核酸复制受阻的关键原因。
　　6、白藜芦醇体内抗DPV活性及对相关细胞因子调节作用研究通过皮下注射接毒的方法建立DPV-CHv强毒株樱桃谷鸭雏鸭DPV模型。接毒后第1～7d分别用不同剂量的白藜芦醇口服灌喂给药，停药后观察7d，结果如下:①各剂量组白藜芦醇均能明显延迟染毒鸭的发病时间和死亡时间:病毒感染组第4d开始发病，第5d开始出现死亡，第8d死亡率为100％;白藜芦醇治疗组第5d开始发病，第6d开始出现零星死亡，第8d各组死亡率均为20％。停药一周后，高、中、低三个治疗组死亡率分别为80％，60％与50％。②白藜芦醇能够明显改善染毒鸭各脏器组织病变情况:病毒感染组鸭全身各脏器有明显出血充血现象，肝脏出现肉眼可见的坏死灶，治疗组无明显肉眼可见的病理变化。HE染色检测，病毒感染组肝脾和法氏囊均出现多个坏死灶，白藜芦醇治疗组肝脾和法氏囊无坏死灶。透射电镜下，病毒感染组肝脾细胞结构严重破坏，细胞胞核和胞质内充满各生长阶段的DPV病毒颗粒。白藜芦醇治疗组肝脾细胞结构完整，胞内无明显可见的DPV病毒颗粒。③白藜芦醇显著抑制病毒在染毒鸭体内的复制:治疗组鸭外周血的DPV病毒拷贝数增长时间比病毒感染组晚2～3d;增长幅度明显低于病毒感染组。④在调节细胞因子方面，不同剂量的白藜芦醇对不同的细胞因子影响不同:与病毒感染组和正常组相比，对INF-α和INF-γ具有促进作用，对IL-2和IL-12具有抑制作用，对IL-4影响不明显;不同剂量之间比较，对INF-α、IL-2和IL-12的影响与浓度呈负相关性，浓度越高，各细胞因子的含量越低，不同剂量组的INF-γ和IL-4差异不明显。剂量越高导致的细胞因子含量越低可能是高剂量组死亡率高于低剂量组的主要原因。
　　由以上结果可知，白藜芦醇具有良好的抗DPV活性，作用机制主要体现在两个方面:一是针对病毒本身，白藜芦醇能够有效抑制DPV立即早期基因及早期基因的转录，阻碍病毒在宿主细胞核内的病毒核酸复制，从而阻断病毒繁殖过程达到抑制病毒的效果，这种抑制效果与白藜芦醇的浓度呈正相关性;二是通过作用于动物机体免疫系统，调节病毒感染相关的细胞因子来达到影响病毒对机体损伤的效果。这种效果与白藜芦醇的剂量之间关系复杂，相同的剂量对不同的细胞因子影响不同。各细胞因子水平在总体上呈现出高剂量抑制、低剂量促进的现象。

目录

论文说明

声明

摘要

常用英文缩写表

第一章 抗疱疹病毒类药物概述

1 化学治疗药物及其作用机制

1．1 化学治疗药物

1．2 作用机制

2 中药及其活性成分

2．1 中药粗提物

2．2 中药有效成分

第二章 白藜芦醇抗病毒研究进展

1 抗疱疹病毒研究

1．1 抗HSV-1和HSV-2研究

1．2 抗VZV病毒研究

1．3 抗HCMV病毒研究

1．4 抗EBV病毒研究

2 抗RNA病毒

2．1 抗HIV病毒研究

2．2 抗IFV病毒

2．3 抗SARS病毒研究

2．4 抗HTLV病毒研究

3 抗其它病毒研究

3．1 抗非洲猪瘟病毒研究

3．2 抗71型肠道病毒研究

第三章 研究背景和目的

1 研究背景

2 研究目的

2．1 对鸭瘟的防治

2．2 对疱疹病毒新靶点的发现

第四章 体外抗DPV活性物质筛选

1 实验材料

1．1 实验药材

1．2 试剂及培养基

1．3 细胞及毒株

1．4 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 细胞培养相关试剂的配制

2．2 鸭胚成纤维细胞的制备

2．3 病毒增殖

2．4 病毒半数组织培养感染量的测定

2．5 DMSO对DEFs体外生长的影响

2．6 中药粗提物抗DPV活性检测

2．7 印楝种仁粗提物萃取各段抗DPV活性检测

2．8 油樟挥发油及其主要活性成分抗DPV活性检测

3 实验结果

3．1 病毒TCID50测定结果

3．2 DMSO对DEFs及DPV的作用

3．3 中药粗提物抗DPV检测结果

3．4 印楝抗DPV检测结果

3．5 油樟挥发油及其主要活性成分抗DPV检测结果

4 分析与讨论

4．1 DMSO作为供试品溶媒在抗病毒活性研究中的使用

4．2 具有抗DPV活性的中药的筛选

4．3 印楝种仁提取物抗DPV活性

4．4 油樟挥发油及其主要活性成分抗DPV活性

5 小结

第五章 白藜芦醇体外抗DPV活性研究

1 实验材料

1．1 实验药材

1．2 试剂及培养基

1．3 细胞及毒株

1．4 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 供试药物的制备

2．2 白藜芦醇对DEFs的毒性实验

2．3 白藜芦醇对DPV的抑制作用

2．4 白藜芦醇对DPV滴度的影响

3 实验结果

3．1 白藜芦醇对DEFs的毒性检测结果

3．2 白藜芦醇对DPV的抑制作用结果

3．3 白藜芦醇对DPV滴度的影响结果

4 分析和讨论

4．1 白藜芦醇的抗病毒活性及评价方法

4．2 白藜芦醇对DPV滴度的影响

5 小结

第六章 TaqMan绝对荧光定量方法的建立和白藜芦醇对DPV体外复制的影响

1 实验材料

1．1 主要试剂

1．2 主要仪器设备

1．3 毒株

1．4 引物和探针

2 实验方法

2．1 FQ-PCR方法的建立

2．2 白藜芦醇对DPV在DEFs中生长曲线的影响

3 实验结果

3．1 FQ-PCR方法的建立

3．2 白藜芦醇对DPV在DEFs中生长曲线的影响结果

4 分析和讨论

4．1 TaqMan FQ-PCR方法

4．2 白藜芦醇对DPV体外生长曲线的影响

5 小结

第七章 白藜芦醇体外抗DPV作用特征的研究

1 实验方法

1．1 实验药材

1．2 试剂及培养基

1．3 细胞及毒株

1．4 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 供试药物的制备

2．2 白藜芦醇对DPV不同作用阶段的作用研究

2．3 不同给药时间下白藜芦醇对DPV毒力的影响

2．4 透射电镜检测白藜芦醇作用下DPV在DEFs中的复制情况

3 实验结果

3．1 白藜芦醇对DPV不同作用阶段研究结果

3．2 不同给药时间下白藜芦醇对DPV毒力的影响结果

3．3 透射电镜检测结果

4 分析和讨论

4．1 白藜芦醇对DPV不同作用阶段的研究

4．2 白藜芦醇抑制DPV主要作用时间段

4．3 白藜芦醇作用下感染了DPV的DEFs超微结构观察

5 小结

第八章 白藜芦醇对DPV立即早期和早期基因转录的抑制作用研究

1 实验材料

1．1 实验药材

1．2 试剂及培养基

1．3 细胞及毒株

1．4 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 供试药物的制备

2．2 引物设计

2．3 总RNA的提取及反转录

2．4 PCR产物回收纯化

2．5 退火温度的筛选

2．6 标准曲线及扩增效率的检测

2．7 白藜芦醇对DPV立即早期和早期基因转录抑制情况的检测

3 实验结果

3．1 RNA完整性及纯度分析

3．2 引物特异性检测

3．3 退火温度

3．4 标准曲线及扩增效率

3．5 白藜芦醇抑制DPV早期基因转录的检测结果

4 分析与讨论

4．1 反转录FQ-PCR方法的应用

4．2 白藜芦醇对DPV早期基因转录的抑制

5 小结

第九章 白藜芦醇体内抗DPV活性及对相关细胞因子调节作用研究

1 实验材料

1．1 主要试剂

1．2 主要仪器设备

1．3 毒株与实验动物

1．4 实验药品

2 实验方法

2．1 实验药品的配制

2．2 DPV鸭胚半数致死浓度的检测

2．3 动物分组及给药

2．4 病理学观察

2．5 各实验组外周血载毒量的检测

2．6 细胞因子检测

3 实验结果

3．1 DPV ELD50检测结果

3．2 临床症状观察

3．3 死亡率统计

3．4 组织病理学检测

3．5 TEM检测结果

3．5 用药期间外周静脉血液中载毒量检测结果

3．6 细胞因子检测结果

4 分析和讨论

4．1 体内实验药物的配制及给药方式

4．2 临床鸭瘟病理模型的建立

4．3 白藜芦醇对鸭瘟的临床治疗效果

4．4 白藜芦醇对DPV在鸭体内复制的抑制作用

4．5 白藜芦醇对细胞因子的影响与治疗作用的关系

5 结论

第十章 结论与创新

1 结论

2 创新性

参考文献

致谢

附图

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