骆驼源和竹鼠源隐孢子虫的分离鉴定及种系发育分析

摘要

隐孢子虫是一种危害严重的细胞内寄生原虫，它主要造成宿主不同程度的腹泻，其寄生范围很广，能感染包括人在内的260多种脊椎动物。研究发现，野生动物是隐孢子虫重要储存宿主，目前研究人员已在不同种类的野生动物身上发现了多个虫种。本实验尝试采用饱和蔗糖漂浮法，从两个黑熊养殖场、成都动物园、碧峰峡野生动物园、贵阳动物园、竹鼠养殖场的野生动物和从成都及雅安地区的大熊猫采集到的共1370份粪便样品中分离隐孢子虫;结合形态学和分子方法对其进行虫种鉴定，再分别采用MLST技术和gp60位点进行亚型鉴定;并对各基因位点测序获得的序列进行同源性分析和构建进化树，研究卵囊所属种类和基因分型地位。
　　结果显示，本实验共分离得到一株骆驼源隐孢子虫和三株竹鼠源隐孢子虫。分离得到的骆驼源隐孢子虫卵囊在饱和蔗糖溶液中呈现淡紫色，残留体透明卵囊呈圆形或卵圆形。400×光镜下平均每个视野可观察到3个卵囊，测量50个卵囊其平均大小为7.03(5.87～7.95)×5.50(4.60～6.00)μm(n=50)。运用巢式PCR扩增出骆驼源隐孢子虫SCBC02分离株18SrRNA、COWP、CpA135三个基因位点序列，测序结果经矫正后提交到Genbank获得登录号。序列同源性分析得出，该分离株在三个基因位点上均与Cryptosporidium andersoni参考序列同源性最高。基于N-J法构建三个位点进化树得出，SCBC02分离株均与Candersoni处于同一分支。最后我们结合镜检观察和全部三个位点序列系统发育分析判断该分离株属于安氏隐孢子虫。利用MLST(multilocussequence typing)方法对其亚型进行鉴定，MS1、MS2、MS3、MS16位点亚型鉴定结果分别为A4、A4、A4、A1，与四川地区奶牛常见隐孢子虫亚型相同。我们推断，骆驼与奶牛之间可能存在隐孢子虫相互传播。将卵囊口服接种至免疫抑制状态下的昆明系鼠、SD大鼠和仓鼠，并连续30 d对这些实验动物的粪便进行隐孢子虫卵囊检测，均未发现虫卵，显示感染不成功。
　　从竹鼠分离得到三株隐孢子虫(YA01、YA02、YA03)，形态相似，在饱和蔗糖溶液中呈现淡紫色，残留体透明卵囊呈圆形或卵圆形。将扩增出的18S rRNA、COWP、CpA135、HSP70、actin位点序列矫正后提交到Genbank并获得登录号。经同源性分析发现，在18S rRNA位点YA01、 YA02、YA03之间没有差异，全部与Cryptosporidium parvum有100％同源性;COWP位点YA03与YA01和YA02有0.3％的差异，YA01、YA02间没有差异，但都与C.parvum同源性最高;HSP70位点YA01、YA03之间没有差异，YA02与另外两株之间存在0.2％的差异;actin位点克隆后测序，分析得出，YA01、YA02、 YA03之间均有差异，与C.parvum参考序列同源性分别为99.7％、99.2％、99.4％; CpA135位点YA01与YA02相同，它们与YA03同源性为99.3％。构建进化树观察到，三株竹鼠源隐孢子虫在所有位点均与C.parvum处于同一分支。综合形态学和分子分型，我们鉴定三株隐孢子虫均为微小隐孢子虫。利用gp60位点对三株隐孢子虫亚型鉴定并命名为ⅡpA9、ⅡpA9、ⅡoA13G1，其中YA01(ⅡpA9)、YA02(ⅡpA9)为新的亚型。
　　综上所述，本试验是四川地区首次检测到骆驼感染隐孢子虫，关于骆驼源隐孢子虫开展的各项实验，丰富了我国骆驼人兽共患寄生虫病研究工作;本实验同时也是世界上首次分离得到三株竹鼠源隐孢子虫，填补了竹鼠隐孢子虫病研究的空白，为竹鼠人兽共患寄生虫病的防控打下基础。

目录

声明

论文说明

摘要

文献综述

1 隐孢子虫简介

2 隐孢子虫的分类学和遗传多态性

3 隐孢子虫的分子鉴定方法

4 野生动物隐孢子虫研究现状

5 骆驼隐孢子虫研究进展

6 竹鼠隐孢子虫研究进展

第一章 野生动物隐孢子虫的检测与分离

1 材料和方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 粪便样品采集

1．3 检测方法

2 实验结果

2．1 隐孢子虫检出率

2．2 隐孢子虫卵囊形态观察

3 讨论

第二章 骆驼源隐孢子虫种系发育分析和动物交叉感染实验

1 材料和方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 骆驼源隐孢子虫样品收集和处理

1．3 卵囊DNA提取

1．4 18S rRNA、COWP、CpA135基因PCR扩增

1．5 MLST技术亚型鉴定

1．6 序列分析及进化树的构建

1．7 骆驼源隐孢子虫的动物交叉感染试验

2 实验结果

2．1 PCR扩增产物结果

2．2 测序结果

2．3 交叉感染实验结果

2．4 同源性分析

2．5 系统发育分析

3 讨论

第三章 竹鼠源隐孢子虫的分离鉴定和种系发育分析

1 材料和方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 竹鼠源隐孢子虫样品收集和处理

1．3 卵囊DNA提取

1．4 18S rRNA、COWP、HSP70、CpA135、gp60、actin基因PCR扩增

2 实验结果

2．1 PCR扩增产物结果

2．2 actin克隆结果

2．3 测序结果

2．4 同源性分析

2．5 系统发育分析

3 讨论

参考文献

致谢

附录

攻读学位期间发表的学术论文目录