大熊猫肠道纤维素分解菌的筛选及β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达

摘要

大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，以富含高纤维素的竹类为主食，但其消化纤维素的能力不佳，主要依赖于其肠道内微生物对纤维素的分解作用，β-葡萄糖苷酶是微生物降解纤维素过程的重要限速酶，不同来源的β-葡萄糖苷酶及其基因在大小、结构以及理化特征上均有不同，本研究从大熊猫肠道内分离筛选得到纤维素分解菌，进一步研究其β-葡萄糖苷酶的活力及影响因素，构建工程菌对β-葡萄糖苷酶基因进行表达，对研究大熊猫肠道微生态制剂具有重要意义。
　　从雅安碧峰峡野生动物园15只大熊猫粪样中分离、筛选得到5株具有分解纤维素能力的细菌，分别对5株菌进行形态学、生理生化鉴定，初步推断5株菌均为芽孢杆菌，将5株菌与相关菌种的16SrDNA序列构建系统发育树，发现均与Bacillussp.(HM17927.1)处于同一分支上，进化距离最短，该结果与BLAST的结果一致。再结合16SrDNA测定序列对比分析，可确定5株菌均为厚壁菌门（Firmicutes）的芽孢杆菌属(Bacilli)。
　　利用水杨苷法分别测得菌株QY、HH、YH、YY、AA的初始β-葡萄糖苷酶酶活分别为3.65 U/mL、2.43 U/mL、2.51 U/mL、1.36 U/mL、7.32 U/mL。选择酶活力较高的菌株QY、YH、AA，通过改变菌株的接种量、培养时间、培养温度、培养基初始pH、碳源、氮源等条件进行产酶条件的优化，最终发现3株菌的酶活力均大幅度提高，分别达到21.83 U/mL、19.05 U/mL、20.77 U/mL。
　　选择酶活最大的菌株QY为β-葡萄糖苷酶基因提供菌，克隆β-葡萄苷酶基因bglH，大小为1321 bp，利用表达载体pET-22b(+)在大肠杆菌BL21成功进行了bglH基因的转化和表达，通过对BL21/pET-bglH诱导后上清进行酶活测定，发现酶活达到36.3 U/mL。
　　对表达粗产物进行β-葡萄糖苷酶酶学性质研究，结果显示，表达得到的β-葡萄糖苷酶最适温度为36℃，最适pH5.5，30℃时热稳定性较好，40℃处理20 min，酶活仍能维持原酶活的60％左右，当在超过50摄氏度的环境处理时，酶活迅速下降，温度越高，酶活下降越快。在pH5-6.5范围内，相对酶活力都较高，在碱性环境中，酶活降低更快，显示出更差的稳定性，当pH超过8时，基本丧失酶活。
　　本研究结果表明，大熊猫肠道内存在能够分解纤维素的细菌，通过对细菌产酶条件的优化，可以提高纤维素分解菌的酶活力，同时对β-葡萄糖苷酶基因的克隆并构建工程菌，成功得到了β-葡萄糖苷酶的高效表达，为以后大熊猫肠道微生态制剂的研制提供了可参考的菌源。

目录

论文说明

声明

摘要

英文缩写及中文对照

文献综述

1 大熊猫消化道分解纤维素的微生物概况

2 纤维素分解酶分解纤维素的机制

2．1 纤维素酶的组成

2．2 纤维素酶降解纤维素的假说

3 β-葡萄糖苷酶的分类

4 β-葡萄糖苷酶的理化性质

5 新的β-葡萄糖苷酶的发现

6 β-葡萄糖苷酶的基因

7 β-葡萄糖苷酶基因克隆与表达进展

7．1 微生物β-葡萄糖苷酶基因的克隆

7．2 植物β-葡萄糖苷酶的基因的克隆

7．3 β-葡萄糖苷酶基因的表达

8 β葡萄糖苷酶的应用

8．1 作为食品风味酶应用

8．2 β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中的应用

8．3 其它应用

实验部分

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 菌株的分离和筛选

2．2 菌株的生理生化特性

2．3 菌株的16SrDNA的PCR扩增及系统发育分析

2．4 3株纤维素酶高产菌的产酶条件优化

2．5 bglH基因的克隆

2．6 bglH基因的序列测定

2．7 重组菌株BL21／pET-bglH的筛选及鉴定

2．8 SDS-PAGE

2．9 表达产物酶反应条件的研究

3 讨论

3．1 纤维素酶分解菌筛选方法的确定

3．2 β-葡萄糖苷酶基因的提供菌选择

3．3 β-葡萄糖苷酶基因

3．4 表达产物的性质研究

4 结论

参考文献

致谢

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