耐热β-葡萄糖苷酶细菌的筛选、基因的克隆与表达

摘要

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase;EC.3.2.1.21)是纤维素酶系中一种重要的水解酶,在工业、农业、医药等领域都有广泛的应用。耐热性β-葡萄糖苷酶具有加快反应速率、降低能耗等优势,在食品发酵、燃料乙醇等领域中具有广阔的应用前景。本文旨在探索一种能与糖化酶协同作用的耐热性β-葡萄糖苷酶,以达到提高淀粉质原料燃料乙醇生产过程中的原料利用率和出酒率的目的。
　　 本文首先通过筛选获得了1株产β-葡萄糖苷酶能力较强的嗜热细菌(F157043A),经过16S rDNA分子生物学鉴定、形态分析以及生理生化鉴定,确定该菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),进一步对该菌的粗酶液进行了酶学性质分析,并将β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中成功地进行了克隆表达。
　　 1.从中国高校工业微生物资源和信息中心(CICIM-CU)菌种库中的1323株细菌保藏物中筛选出20株产β-葡萄糖苷酶能力较强的细菌;通过16S rDNA序列鉴定,初步确定其中5株为嗜热溶胞土芽孢杆菌(Geobacillus sp.),其余为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis);进一步复筛获得两株产酶能力较优的细菌(编号为170-28-2的嗜热溶胞杆菌与编号为F157043A的地衣芽孢杆菌)并对其产生的β-葡萄糖苷酶酶学性质进行了初步的分析;选取具有较好耐热性与较宽pH耐受性的F157043A菌株作进一步的研究。
　　 2.通过对编号为F157043A的细菌进行菌体和菌落形态观察以及生理生化特征分析,进一步鉴定该菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
　　 3.对该菌β-葡萄糖苷酶的粗酶液酶学性质分析发现:该酶最适反应温度为55℃,在60℃酶活力保持在80％以上;最适反应pH值为9.0,在pH为6.0～9.0范围内酶比较稳定;木糖、葡萄糖、果糖对该酶的酶活力有明显的抑制作用;Cu2+、Zn2+、Ca2+、SDS对酶活力有很强的抑制作用,Mg2+、Co2+、Mn2+对酶活力有明显的激活作用;不同浓度的酒精对酶活力有不同程度的抑制作用。
　　 4.以地衣芽孢杆菌F157043A的染色体为模板PCR扩增获得1410bp的β-葡萄糖苷酶基因(bglH),将该片段连接至表达载体pET-20b(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组子;重组菌经IPTG诱导表达后,在SDS-PAGE上检测到约53 kDa的重组蛋白条带;在60℃条件下重组菌粗酶液比酶活为0.14 U/mg,对照菌粗酶液比酶活为0.04U/mg;在较适诱导条件下重组菌粗酶液比酶活为0.54 U/mg,提高了约4倍。
　　 5.针对实验过程中发现大肠杆菌BL21(DE3)具有本底β-葡萄糖苷酶酶活而公开文献均未提及这一现象,通过设计实验证明并初步阐明了IPTG能够促进大肠杆菌BL21(DE3)的磷酸化β-葡萄糖苷酶A的生成。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 β-葡萄糖苷酶的简介

1.1.1 β-葡萄糖苷酶的分类

1.1.2 β-葡萄糖苷酶的生化性质

1.1.3 β-葡萄糖苷酶的催化反应机制

1.1.4 β-葡萄糖苷酶活性测定方法

1.2 β-葡萄糖苷酶的应用价值

1.2.1 β-葡萄糖苷酶在燃料乙醇工业中的应用前景

1.2.2 β-葡萄糖苷酶在其他方面的应用

1.3 β-葡萄糖苷酶的研究概况

1.4 立题意义

1.5 研究内容

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种与质粒

2.1.2 试剂

2.1.3 工具酶

2.1.4 其他材料

2.1.5 主要仪器

2.1.6 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 菌种筛选

2.2.2 大肠杆菌磷酸化β-葡萄糖苷酶A的研究

2.2.3 β-葡萄糖苷酶的克隆与表达

第三章 结果与讨论

3.1 产β-葡萄糖苷酶细菌的初筛

3.2 产β-葡萄糖苷酶细菌的复筛

3.3 分子生物学鉴定

3.4 粗酶液酶学性质初步分析

3.4.1 粗酶液最适反应温度研究

3.4.2 粗酶液最适反应pH的研究

3.4.3 粗酶液热稳定性的研究

3.4.4 粗酶液pH稳定性的研究

3.4.5 粗酶液比酶活的比较

3.5 菌株的形态观察与生理生化鉴定

3.6 地衣芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶酶学性质的进一步分析

3.6.1 不同糖类对酶活力的影响

3.6.2 不同金属离子对酶活力的影响

3.6.3 不同酒精浓度对酶活力的影响

3.7 大肠杆菌磷酸化β-葡萄糖苷酶A(P-β-glucosidaseA)的研究

3.7.1 大肠杆菌磷酸化β-葡萄糖苷酶A的验证

3.7.2 IPTG对大肠杆菌磷酸化β-葡萄糖苷酶A的影响

3.7.3 IPTG的促进作用原理分析

3.7.4 大肠杆菌磷酸化β-葡萄糖苷酶A的最适反应温度

3.8 重组菌的构建与表达

3.8.1 地衣芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因(bglH)的PCR扩增

3.8.2 重组质粒的构建

3.8.3 pET-20b(+)-bglH在大肠杆菌中的诱导表达

3.8.4 诱导条件的优化

3.9 大肠杆菌本底酶活对重组菌酶活影响的探讨

3.10 主要结论与展望

3.10.1 主要结论

3.10.2 展望

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文