牛丘疹性口炎病毒的分离、全基因组测序及其生物信息学分析

摘要

牛丘疹性口炎病(BPS)是牛的一种高度传染性的、普遍存在的疾病，该病由牛丘疹性口炎病毒引起。它是能引起牛和人的一种急性、接触性、嗜上皮性传染病。牛丘疹性口炎病的特点是常在皮肤或嘴唇的粘膜，齿垫，上颚，舌头，乳房，口角出现丘疹和溃疡。在牛丘疹性口炎流行地区，发病率可高达90％以上，死亡率较低，但能使牛哺乳期中断和产奶量下降，影响牛肉和皮的品质，还会引起续发感染。国内外对该病的致病机理还没有系统的研究和报道，基因组序列的数据稀少，有关基因功能的研究更加稀少，因此希望能够通过我们的研究，为牛丘疹性口炎病的研究提供一定的基础。主要研究内容如下:
　　1.通过观察牛病理特征，采集病料做病理切片，病毒接种于细胞分离，病毒形态电镜显示成卵圆形，以及PCR的特异性检测，基因产物的测序和比对，检测和分离到了牛丘疹性口炎病毒。
　　三岁的安格斯公牛，已有两个月的慢性肩部感染，颈部、腹部皮肤有突起的结节，尸检肩部出现脓肿脓液，多个浅表淋巴结肿大。并且在牛前肢两侧末端皮肤有慢性皮肤增殖病和肿胀。四肢皮肤广泛性病理增生，皮肤溃疡出血病有灶融合。组织病理学检查显示前肢上皮乳头状增生、过度角质化、真皮炎症浸润。角化细胞气球样变性和可见到嗜酸性胞浆内包涵体的等特征。电镜检查显示出典型的卵圆形副痘病毒属病毒粒子。根据已经发表的牛丘疹性口炎病毒BPSV-024基因序列设计PCR引物，并且用PCR技术从病毒(TX09)感染的细胞中扩增到了预期的目的条带。该扩增的DNA序列通过核苷酸比对，结果显示与牛丘疹性口炎病毒AR02株的同源性达到100％，通过病理学，电镜，PCR扩增特异条带，序列分析确定该病毒为牛丘疹性口炎病毒。
　　2.牛丘疹性口炎病毒全基因组测序与C5、C15和C1病毒的分离纯化为了进一步研究评估临床分离的牛丘疹性口炎病毒基因组特性，用该病毒感染细胞并进行病毒的DNA提取，用Illumina MiSeq平台的第二代测序相关技术设备进行全基因测序分析。根据对所得结果的初步分析，该序列和当前已发表的基因库序列牛丘疹性口炎病毒AR02株(基因库Acc.AY386265)，存在高度相似，值得注意的是，几个基因位点有明显的异质性，表明临床分离病毒中存在几种基因型的情况。
　　从第一次分离的病毒，全基因测序后发现，同一样品中测序结果显现出3种相似度很高的基因序列情况，为了便研究病毒基因的特性，命名为C5、C15、C1，我们用病毒蚀斑纯化的方法进行病毒的分离，根据其各自基因酶切位点的不同和基因的特异性，分别用stuⅠ酶酶切鉴定C5-VEGF和C15-VEFG基因来筛选C5和C15病毒;PCR检测特殊基因ATI，蚀斑行筛选纯化C1病毒。通过多代的筛选纯化，最终得到了相似度很高C5、C15、C1病毒。
　　3.对筛选到的牛丘疹性口炎病毒基因进行测序比对
　　对筛选到的C5、C15和C1牛丘疹性口炎病毒，再进行全基因测序，基因序列开放阅读框(ORF)的确定使用EMBOSS工具和田纳西州大学橡树岭国家实验室的Prodigal程序分析，分别找到了132个开放阅读框，标注了基因的起始和终止位置，并且和已经发表的牛丘疹性口疮病毒基因库序列AR02(基因库Acc.AY386265)进行比对。注明了其相对位置和标注其蛋白功能，表格列出了3株病毒中差异明显的开放阅读框共17个(ORF006，ORF008，ORF009，ORF012，ORF020, ORF029, ORF102, ORF103, ORF104, ORF109, ORF110, ORF118,ORF119, ORF120, ORF123, ORF123,ORF124,ORF127)。
　　4.C5、C15和C1病毒动物接种试验
　　用纯化到的C5、C15和C1病毒感染细胞，不同时间段收病毒，检测TCID50绘制生长曲线，结果显示C5、C15和C1病毒表现了类似生长趋势。并用病毒C5、C15和C1分别接种家兔进行动物接种试验，家兔在接种的7天显现脓疱，第11天脓疱破溃，2周后结痂痊愈，且在结痂中检测到了相应的病毒。
　　5.用酵母双杂交系统初步筛选了与C1-ORF118相互作用蛋白
　　以ORF118基因序列为模板，特异性引物扩增ORF118基因，并连接到pGBKT7酵母表达载体上，构建pGBKT7-ORF118诱饵载体，并对构建好的诱饵载体进行鉴定、自激活检测和细胞毒性检测。PCR结果和双酶切得到了579bp大小目的条带。诱饵质粒pGBKT7-Ⅱ8转Y187和AH109感受态细胞，且培养于缺陷培养基SD/-TRP/-His、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu，培养基上均无菌落生长，在培养基SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal仅生长白色菌落，表明诱重组诱饵质粒对Y2HGold酵母无毒性和自激活效应。可以用于MDBK细胞的cDNA文库进行酵母双杂交筛选。
　　利用酵母双杂交技术，将所构建的pGBKT7-118诱饵载体与MDBK的cDNA文库进行杂交，用SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu和SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu/X-α-gal缺陷性固体培养基筛选相互作用的蛋白。经过多轮筛选，得到了18个可能与ORF118基因有相互作用的阳性克隆，最后对阳性克隆进行测序，得到4个蛋白:半乳糖凝集素3、核糖体蛋白、热应激蛋白、主要组织相容性复合体Ⅰ等。

目录

声明

摘要

常用英文缩略词汇

第一章 文献综述

1．牛丘疹性口炎病毒的研究进展

1．1 牛丘疹性口炎病毒流行病学特征

1．2 临床症状

1．3 病毒基因组结构

1．4 主要的毒力基因

1．5 免疫治疗和重组疫苗

2．痘病毒的免疫防御分子

2．1 细胞外防御蛋白

2．2 细胞内防御蛋白

第二章 牛丘疹性口炎病毒的分离

1．材料

1．1 主要试剂

1．2 主要仪器

2．方法

2．1 流行情况及临床症状

2．2 样品的采集

2．3 病理组织学切片的制作

2．4 病毒的初步分离培养

2．5 病毒的电镜观察

2．6 PCR检测目的基因

3．试验结果与分析

3．1 流行情况及临床症状

3．2 组织切片鉴定

3．3 病毒的初步分离培养结果

3．4 病毒粒子电镜图

3．5 PCR扩增产物和测序结果

4 讨论

5 小结

第三章 牛丘疹性口炎病毒全基因组测序与C5、C15和C1病毒的分离纯化

1．材料

1．1 细胞和病毒

1．2 主要试剂

1．3 主要试剂盒

1．4 主要仪器

2．方法

2．1 病毒TX09全基因测序

2．2 C5、C15病毒的纯化

2．3 C1病毒的纯化

3．实验结果和分析

3．1 C5、C15病毒的纯化

3．2 C1病毒的纯化

4．讨论

5．小结

第四章 牛丘疹性口炎病毒C15、C5和C1开放阅读框的标注

1．材料和方法

1．1 实验病毒基因序列

1．2 实验软件及数据库

2 实验方法

3 结果与分析

3．1 C15，C5，C1病毒同源性比对

3．2 C15，C5，C1病毒开放阅读框的确定

3．3 密码子偏爱性分析

4．讨论

5．小结

第五章 牛丘疹性口炎病毒C15、C5和C1差异开放阅读框的比对

1．材料

1．1 病毒

1．2 主要使用的软件

2 方法

3．结果与分析

4．讨论

5．小结

第六章 C5、C15和C1病毒动物接种试验

1．材料

1．1 细胞、病毒和实验动物

1．2 主要试剂

1．3 主要试剂盒

1．4 主要仪器

2．方法

2．1 病毒的增殖

2．2 病毒C5、C15、C1细胞培养物TCID50的测定

2．3 生长曲线的绘制

2．4 动物接种试验

3．结果与分析

3．1 病毒C5、C15、C1细胞培养物TCID50的测定

3．2 生长曲线的测定

3．3 动物接种试验

4 讨论

5 小结

第七章 酵母双杂交初步筛选与C1-ORF118相互作用的蛋白

1．材料

1．1 载体及菌株

1．2 主要试剂的配制

1．3 主要试剂盒

1．4 主要仪器

2．方法

2．1 重组质粒的构

2．2 酵母双杂交试验

3．阳性质粒基因测序

4．试验结果与分析

4．1 病毒ORFV118基因的扩增

4．2 酵母载体酶切

4．3 重组质粒的鉴定

4．4 重组诱饵质粒pGBKT7-118的毒性及自激活检测

4．5 诱饵质粒pGBKT7-118和文库酵母双杂交筛选

5．讨论

6．小结

全文总结

本论文的创新点

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文