油茶粕蛋白水解物与多糖的制备及其生物活性评价

摘要

油茶（Camellia oleifera）为我国特有木本油料作物，广泛分布在我国中部、南部地区。山茶油由油茶籽提取而来，因其富含不饱和脂肪酸和多种生物活性成分，被誉为“东方橄榄油”。在山茶油生产过程中，产生了一系列副产物如油茶粕、皂角等。这些副产物常被用作有机肥和燃料，甚至被当作垃圾丢弃，不但没有产生经济效益，反而造成了一定的环境压力。因此，充分开发利用油茶粕具有一定的实用价值和开发意义。蛋白和多糖作为生物大分子，拥有多种生物活性和高的营养价值，正越来越受到大众的青睐。油茶粕含有丰富的蛋白和多糖。本文分析了油茶粕蛋白及其蛋白酶水解物的功能特性和抗氧化活性，评价了油茶粕多糖的抗氧化和抗癌活性。为充分开发利用油茶粕蛋白和多糖，提高油茶粕经济价值，提供理论依据和方法参考。主要研究结果如下:
　　1.正交优化油茶粕蛋白(SCP)和多糖(COP-c)同时提取工艺，其正交优化提取条件为:碱液pH10，料液比1∶30，提取时间3h，提取温度60℃。在此条件下，SCP和COP-c得率分别为4.93±0.13％和4.91±0.09％。
　　2.油茶粕蛋白(SCP)经超滤分成分子量不同的两部分组分(≥10 kDa和＜10kDa)。超滤组分＜10 kDa拥有良好的持油性，但持水性较差，而超滤组分≥10 kDa则相反。SCP同超滤组分＜10 kDa一样，拥有良好的蛋白溶解性，但泡沫稳定性较差;超滤组分≥10 kDa显示出良好的泡沫稳定性和乳化性;pH和温度对其功能特性的影响因分子量不同而不同，超滤组分＜10 kDa的较耐高温，80℃下依然拥有良好的乳化稳定性，但酸性环境中其乳化稳定性和泡沫稳定性较弱。SCP与其超滤组分在60℃表现出最好的蛋白溶解性和乳化性。
　　3.采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶等五种蛋白酶分别水解SCP制备蛋白水解物(SCPH)，并分析了SCPH的分子量分布、功能特性和抗氧化活性。结果显示酶水解能显著提高蛋白溶解性，但损害了蛋白起泡性和乳化性。碱性蛋白酶制备的SCPH拥有最高水解度(DH)和最好的抗氧化活性，同时在较宽的pH环境中均有良好的蛋白溶解性。风味蛋白酶制备的SCPH有低的多肽分子量分布，但拥有最好的铜离子螯合能力和乳化稳定性。胰蛋白酶处理SCP的起泡性较SCP本身的好。表明蛋白酶类型影响蛋白水解物的分子量分布、功能特性和抗氧化活性。
　　4.采用碱性蛋白酶制备不同DH（10％、20％、30％和40％）的SCPH，并分析其功能特性和抗氧化活性。随着水解进行，DPPH清除活性随水解时间延长呈先升后趋于平衡趋势，铜离子螯合能力则随水解时间延长而降低，铁离子螯合能力和超氧阴离子清除活性呈先升后降趋势。蛋白溶解性、起泡性和乳化性受pH和DH值的影响。 DH≤30％的SCPH拥有良好的蛋白功能特性，而进一步水解(DH40％)将严重损害蛋白功能特性。DH20％和30％ SCPH拥有良好的抗氧化活性和功能特性。因此，可以通过选择合适的蛋白酶类型和控制DH来制备拥有良好生物活性和功能特性的蛋白水解物。
　　5.油茶粕粗多糖(COP-c)经超滤分成4种不同分子量的组分，并经DEAE离子纤维素树脂和葡聚糖凝胶G-100纯化得4种不同多糖COP-1、COP-2、COP-3和COP-4。其分子量分别为7.9、36、83和225 kDa，并拥有类似的红外光谱。COP-2和COP-3拥有最好的自由基清除活性。COP-1的金属螯合能力最好。COP-4拥有最差的抗氧化活性和金属螯合能力。表明多糖生物活性受其分子量影响，中等分子量的油茶粕蛋白拥有最好的抗氧化活性，低分子量则表现最好的金属螯合能力，而高分子量的抗氧化活性和金属螯合能力最弱。此外，所有多糖抑制HeLa和HepG2细胞增殖活性不显著。

目录

声明

摘要

符号说明

1 文献综述

1．1 油茶资源简介

1．2 氧化与抗氧化

1．3 蛋白功能特性

1．4 抗氧化肽

1．5 生物活性多糖

1．6 立题依据

2 材料与方法

2．1 材料与仪器

2．2 油茶粕蛋白(SCP)与粗多糖(COP-c)同时提取优化

2．3 蛋白超滤组分的制备

2．4 基本化学成分测定

2．5 蛋白内源荧光光谱扫描

2．6 油茶粕蛋白酶解物(SCPH)的制备

2．6．1 蛋白酶解物的制备

2．6．2 水解度(DH)的测定

2．6．3 氨基酸组分测定

2．6．4 排阻色谱(SEC)分析

2．7 蛋白功能特性测定

2．7．1 持水性与持油性

2．7．2 蛋白溶解度测定

2．7．3 蛋白起泡性能测定

2．7．4 蛋白乳化性能测定

2．8 抗氧化活性测定

2．8．1 DPPH自由基清除活性

2．8．2 羟基自由基清除活性

2．8．3 超氧阴离子自由基清除活性

2．8．4 总还原力

2．8．5 铁离子螯合能力

2．8．6 铜离子螫合能力

2．9 抗肿瘤活性测定

2．9．1 细胞培养

2．9．2 抗癌活性测定

2．10 多糖超滤组分的制备

2．11 多糖红外光谱扫描

2．12 单糖组分GC-MS分析

2．13 统计与分析

3 结果与分析

3．1 SCP与COP-c的同时提取

3．2 SCP及其超滤组分基本化学组成

3．3 SCP及其超滤组分光谱特征

3．3．1 内源荧光光谱

3．3．2 紫外光谱

3．4 SCP及其超滤组分的功能特性

3．4．1 持水性与持油性

3．4．2 pH和温度对蛋白溶解性的影响

3．4．3 pH和温度对蛋白FC与FS的影响

3．4．4 pH和温度对蛋白EAI与ESI的影响

3．5 不同蛋白酶水解SCP制备SCPH

3．5．1 蛋白水解曲线

3．5．2 氨基酸组成分析

3．5．3 SEC分析

3．6 不同蛋白酶制备的SCPH功能特性分析

3．6．1 蛋白溶解性分析

3．6．2 起泡性能分析

3．6．3 乳化性能分析

3．7 不同蛋白酶制备的SCPH抗氧化活性分析

3．7．1 DPPH自由基清除活性分析

3．7．2 总还原力分析

3．7．3 金属螫合活性分析

3．8 碱性蛋白酶水解SCP制备不同DH的SCPH

3．8．1 蛋白水解曲线

3．8．2 水解时间对蛋白酶解物抗氧化活性的影响

3．9 不同DH对SCPH功能特性的影响

3．9．1 蛋白溶解性

3．9．2 蛋白起泡性能分析

3．9．3 蛋白乳化性能分析

3．10 不同DH对SCPH抗氧化活性的影响

3．10．1 DPPH自由基清除活性分析

3．10．2 超氧阴离子自由基(O2·-)清除活性分析

3．10．3 总还原力

3．10．4 金属螯合活性分析

3．11 SCPH氨基酸组成与分子量分布

3．11．1 氨基酸组成分析

3．11．2 SEC分析

3．12 油茶粕多糖及其超滤组分的生物活性及结构表征

3．12．1 化学组成

3．12．2 红外光谱特征

3．12．3 抗氧化活性分析

3．12．4 金属螯合活性分析

3．12．5 抗癌活性分析

4 讨论

4．1 油茶粕蛋白功能特性

4．2 酶法改善油茶粕蛋白功能特性

4．3 油茶粕蛋白水解物的生物活性

4．4 油茶粕多糖的生物活性

结论

参考文献

致谢

在读期间科研成果