PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响

摘要

磷酸酪氨酸互作结构域1（Phosphotyrosine interaction domain containing1，PID1）是一个近期发现的在肥胖者腹膜后脂肪组织中高表达的基因，后续研究发现该基因参与胰岛素抵抗，并且可能与脂质代谢有关。相关性分析发现，不同肌内脂肪含量的猪PID1表达量与肌内脂肪的沉积呈显著正相关。因此，PID1可能是影响肌内脂肪沉积的候选基因。本研究以猪肌内前体脂肪细胞为研究对象，探讨PID1基因对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响，主要研究内容及结果如下:
　　1.猪PID1基因原核表达、纯化、多克隆抗体制备及组织表达谱分析
　　以pET28a(+)为载体，大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌表达猪PID1基因CDS区和组氨酸标签融合的重组蛋白。SDS-PAGE显示表达出的蛋白分子量约32 kDa，经过表达条件的优化，重组蛋白能够在30℃、经0.1 mmol/L IPTG诱导4h得到高效表达，表达量达到宿主菌总蛋白的60％。溶解性分析表明重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体使用6 mol/L盐酸胍溶解后，使用亲和层析法进行纯化，最终重组蛋白浓度达到了1.6 mg/mL，并且SDS-PAGE检测可见单一条带。对纯化后的蛋白进行质谱鉴定，结果表明纯化的重组蛋白为猪PID1蛋白。重组蛋白经稀释法复性后处理增殖中的3T3-L1前体脂肪细胞，发现该蛋白能促进3T3-L1前体脂肪细胞增殖，表明复性后的蛋白具有生物学活性。
　　另外，本研究用纯化后的蛋白多次免疫SD大鼠的方法制备多克隆抗体。多克隆抗体的效价和特异性分别用间接酶联免疫反应和Western Blot鉴定。ELISA结果表明，制备的多克隆抗体滴度达1∶20480; Western Blot结果显示该多克隆抗体能够特异性识别PID1蛋白，表明多克隆抗体制备成功，这将为研究PID1的功能提供一个很好的工具。
　　以10周龄DLY猪为研究对象，使用自制的多克隆抗体检测了PID1基因在腰大肌、趾长伸肌、脂肪、背最长肌、肾、肺、脾、肝脏和心脏中的表达情况，发现PID1蛋白主要表达于肌肉组织，其次是肝脏。这表明PID1可能影响脂质代谢，尤其可能影响肌肉组织中脂质代谢。因此，PID1可能是影响肌内脂肪沉积的候选基因。
　　2.PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响
　　哺乳动物肌内脂肪的80％以上存储于肌内脂肪细胞中，因此本试验探讨了PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响。首先，采用差数贴壁法从3日龄DLY猪背最长肌中分离肌内前体脂肪细胞，免疫荧光检测前脂肪细胞特异性基因Pref-1的表达，结果发现几乎100％细胞表达Pref-1;同时油红O染色结果显示本试验分离的细胞能够分化为成熟脂肪细胞。其次，采用添加猪PID1重组蛋白和转染PID1过表达载体pcDNA3.1(+)-pPID1两种方法，探讨PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖的影响。结果发现重组猪PID1蛋白处理以及转染pcDNA3.1(+)-pPID1均能促进猪肌内前体脂肪细胞的增殖。最后，为了研究PID1对猪肌内前体脂肪细胞分化的影响，处理组细胞转染0.5μg pcDNA3.1(+)-pPID1，对照组转染等量的pcDNA3.1(+)，诱导分化8 d之后检测脂肪细胞分化相关基因的表达。结果表明PID1过表达显著上调脂肪细胞分化主要转录因子C/EBPα、PPARγ的mRNA水平和蛋白水平，并且显著上调脂肪细胞分化早期标志基因LPL的mRNA水平，这表明PID1能促进猪肌内前体脂肪的分化。
　　综上所述，本研究首次用原核表达系统、亲和层析纯化以及稀释复性的方法制备了具有生物学活性的猪PID1重组蛋白及其多克隆抗体;用制备的多克隆抗体检测猪PID1组织表达情况，发现PID1蛋白主要表达于肌肉组织和肝脏，表明PID1可能是影响肌内脂肪沉积的候选基因;通过转染猪PID1重组质粒或添加猪PID1重组蛋白于猪肌内前体脂肪细胞，探讨PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响，首次提供了PID1促进猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的依据。

目录

论文说明

声明

摘要

本文主要缩略语

前言

第一章 文献综述

一、脂肪细胞的增殖和分化

1 脂肪细胞的增殖和分化

2 脂肪细胞增殖的调控

3 脂肪细胞分化相关基因

二、PID1基因研究现状

1 PID1基因的发现

2 PID1的结构

3 PID1的分布

4 PID1与脂肪沉积

三、存在的问题、本研究的目的、内容和意义

1 存在的问题

2 本研究目的

3 本研究内容

4 本研究意义

5 技术路线

第二章 试验研究

试验一 猪PID1基因原核表达、纯化、多克隆抗体制备及组织表达谱分析

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

试验二 PID1对猪肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响

1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

第三章 全文总结

1 本研究主要结论

2 本研究主要创新点

3 有待于进一步研究的问题

参考文献

致谢

个人简历