都江堰鹅观草(Roegneria kamoji cv.Dujiangyan)高分子谷蛋白基因克隆

摘要

高分子量麦谷蛋白是麦类作物种子胚乳中重要的贮藏蛋白之一，其组成和含量直接影响着小麦面粉的加工品质。高分子谷蛋白基因的组成和种类是小麦品质的一个重要指标。普通小麦的近缘种属植物中有许多可供改良小麦产量和品质性状的基因。一些新型的高分子谷蛋白基因从披碱草属、拟鹅观草属、赖草属、山羊草属、偃麦草属、黑麦草属及旱麦草属等物种中被克隆出来。目前关于鹅观草高分子谷蛋白基因的克隆与表达尚未见报道。鹅观草属（RoegneriaC.Koch）是小麦族中最大的属之一，全世界大约有130余种，我国约70余种。鹅观草(Roegneria kamoji Keng)为六倍体(2n=6x=42)物种，含StYH基因组。鹅观草分布范围广，我国除青海和西藏等地外，几乎遍及全国，主要生长在海拔为100米到2300米的山坡和湿润的草地上，可作为优良的牧草品种。“都江堰鹅观草”为四川农业大学小麦研究所选育的鹅观草牧草新品系，2015年通过国家草品种区域试验。全株绿色，叶丛茂盛，适口性好，分蘖能力强。耐贫瘠，抗病虫性强，适应性广，可用于我国长江中国上游地区退耕还草、种草养畜及水土保持等方面。
　　本文对都江堰鹅观草高分子谷蛋白基因进行研究。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测到一条迁移率稍大于1Dy12的高分子谷蛋白带。对该基因片段进行克隆、测序及原核表达分析，并与普通小麦及小麦族物种的高分子谷蛋白基因进行系统进化分析。主要结果如下:
　　1.都江堰鹅观草的高分子谷蛋白组成分析
　　通过对单粒都江堰鹅观草种子的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，检测到其只有1条高分子谷蛋白带，与对照材料中国春(CS)、川育12(CY12)比较，该条带电泳迁移率稍大于1Dy12。
　　2.都江堰鹅观草高分子谷蛋白基因序列分析
　　通过PCR扩增、测序得知:都江堰鹅观草高分子谷蛋白基因大小为1212 bp，编码404个氨基酸，具有典型的高分子谷蛋白亚基基因特征:在5'端具有一个由21个氨基酸组成的信号肽和104个氨基酸组成的N-端;在3'端有一个由42个氨基酸组成的C-端。与已知23个麦类及多年生野生近缘物种的高分子谷蛋白基因进行比对分析，结果显示:该基因的N-端与y-型亚基及含St基因组的小麦族物种具有较高的同源性;C-端则与x-型亚基及含St基因组的小麦族物种具有较高的同源性;C-端具有x-型特有的短肽LAAQLPAMCRL。
　　3.系统进化分析
　　将都江堰鹅观草高分子谷蛋白基因与已发表的23个包括小麦属、山羊草属、大麦属、拟鹅观草属、披碱草属等物种的高分子谷蛋白亚基进行N-、C-端聚类分析。根据N-端聚类，聚为两大支:含St基因组的多年生物种的高分子谷蛋白亚基与麦类y-型亚基、大赖草的Glu-1-2、大麦D-hordein以及澳冰草的Glu-W1-1、Glu-W1-2聚为一大支，麦类x-型亚基聚为另一大支。都江堰鹅观草高分子谷蛋白基因与来自拟鹅观草属的Glu-1St1、Glu-St1、来自披碱草属的1St1.3、Glu-St2以及来自大赖草的Glu-1-2以94％的支持率聚为一小支，表明都江堰鹅观草高分子谷蛋白基因N-端与麦类y-型亚基、Glu-1St1、Glu-St1、1St1.3、Glu-St2、Glu-1-2的N-端具有一定的遗传相似性。可推断该高分子谷蛋白亚基由都江堰鹅观草的St基因组所表达。从C-端聚类来看，也聚为两大支:都江堰鹅观草高分子谷蛋白亚基与麦类x-型亚基、来自披碱草属的1St1.3、Glu-St2、来自拟鹅观草属的Glu-St1、Glu-1St1、大麦D-hordein以及大赖草Glu-1-2聚为一支;而麦类y-型亚基则单独聚为一支。结果表明都江堰鹅观草高分子谷蛋白基因C-端与麦类x-型亚基、1St1.3、Glu-St2、Glu-St1、Glu-1St1、D-hordein、Glu-1-2的C-端具有一定的遗传相似性。综合N-、C-端聚类分析可见，都江堰鹅观草高分子谷蛋白N-端类似于y-型亚基，C-端类似于x-型亚基。
　　4.都江堰鹅观草高分子谷蛋白的体外表达
　　设计一对不含信号肽编码区的表达引物，从整合有上述都江堰鹅观草HMW-GS基因的质粒PMD19-T中扩增出该基因，将扩增片段克隆到表达载体pET-30上，转化表达菌株BL21(DE) plySs。经IPTG诱导后，该编码基因在Escherichia coli中获得了表达。通过SDS-PAGE分析可以看出，体外表达的蛋白与种子中的高分子谷蛋白迁移率基本一致，表明了都江堰鹅观草的HMW-GS基因体外表达成功。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．文献综述

1．1 小麦高分子谷蛋白

1．1．1 高分子谷蛋白亚基的类型

1．1．2 高分子谷蛋白亚基的结构

1．1．3 高分子谷蛋白亚基与品质的关系

1．2 麦类HMW-GS基因研究进展

1．3 都江堰鹅观草(Roegneria kamoji cv．Dujiangyan)

1．4 立题依据

2．材料与方法

2．1 供试材料

2．2 试验方法

2．2．1 种子高分子谷蛋白提取

2．2．2 SDS-PAGE分析

2．2．3 分子克隆

2．2．4 DNA序列测定与分析

2．2．5 原核表达

3．结果与分析

3．1 都江堰鹅观草SDS-PAGE分析

3．2 都江堰鹅观草HMW-GS基因克隆

3．3 都江堰鹅观草HMW-GS基因序列分析

3．4 原核表达

3．5 聚类分析

4．讨论

4．1 都江堰鹅观草HMW-GS基因特征

4．2 都江堰鹅观草HMW-GS基因系统进化

4．3 HMW-GS编码基因的体外表达

4．4 HMW-GS基因的沉默机制

5．结论

参考文献

致谢