苦胆链霉菌YJ1活性代谢产物的分离纯化及其粗提物对油菜菌核病的生物防治

摘要

油菜是我国乃至世界上的重要油料作物，油菜菌核病是限制油菜生产的主要因素，利用拮抗放线菌防治油菜菌核病是一种安全有效的生物防治手段。因此，进一步研究拮抗放线菌次级代谢产物有效组分对于研发出防治油菜菌核病的新型农用抗生素具有重要意义。本试验以实验室前期工作中筛选出的一株对油菜菌核病菌有较强拮抗活性的苦胆链霉菌Streptomyces felleusYJ1为研究对象，通过一系列方法和技术测定了活性代谢产物的分布及理化性质，对其活性物质进行分离纯化，并测定了其发酵液粗提物的毒力和抗菌谱及其对油菜菌核病的室内盆栽防治效果，为生防放线菌的进一步开发利用提供了试验依据。主要研究结果如下:
　　1.放线菌YJ1活性代谢产物的分布及理化性质研究
　　本章通过一系列试验，确定活性代谢产物广泛分布于放线菌YJ1发酵上清液和菌丝体中，抑菌率分别为91.15％、86.95％。然而，菌丝体活性物质的酸碱稳定性和热稳定性均非常差，不利于进一步分离纯化，因此，仅选取发酵上清液做下一步研究，菌丝体部分则直接过滤舍弃。同时，发酵上清液中，活性物质的酸碱稳定性和在中性及碱性条件下的热稳定性均较好，抑菌率达到88.51％以上，只在酸性条件下温度过高会对活性物质造成破坏，所以应避免在酸性条件下对活性产物进行高温处理。通过比较二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇在不同pH值条件下对活性物质的萃取效果，确定正丁醇在碱性条件下(pH10)是最佳的萃取条件。此外，溶解性研究结果表明，活性代谢产物的醇溶性较好，可初步判断其极性中等偏大。
　　2.放线菌YJ1活性代谢产物的分离纯化
　　放线菌YJ1活性产物的分离纯化过程主要包括预处理、萃取、薄层层析(TLC)条件探索、硅胶柱层析分离、TLC产物制备、高效液相色谱(HPLC)分析。研究结果为:(1)预处理中，将发酵液的pH值调为5以去除杂质;(2) TLC确定溶剂系统为正丁醇∶甲醇=5∶1(v/v);(3)硅胶柱层析中，采用梯度洗脱，淋洗剂为正丁醇与甲醇;(4)HPLC分析条件:分析色谱柱:Kromasil100-5C18250×4.6mm;流动相:乙腈∶水=80∶20(v/v);流速:0.8 mL/min;检测波长:210nm;色谱柱温度:25℃。
　　3.放线菌Y J1发酵液粗提物毒力及抑菌谱测定
　　放线菌YJ1发酵液经过预处理后，萃取得到其粗提物。粗提物毒力测定结果表明，EC50为297.3719μg/mL，EC90为1312.1999μg/mL，相关系数r为0.9742。以EC90为基础，配制粗提物标准液，发酵液经过0.22μm微孔滤膜过滤后作为原液对照，测定二者对15种植物病原真菌的抑制作用。结果显示，放线菌YJ1无菌发酵液及其粗提物标准液对烟草赤星病菌、苹果落叶斑点病菌、番茄早疫病菌、马铃薯早疫病菌、辣椒灰霉病菌、黄瓜炭疽病菌等多种植物病原真菌都有不同程度的抑制作用，抑制率均达到60％以上，抑菌谱基本一致，但无菌发酵液对植物病原真菌的抑制率要普遍高于粗提物标准液。
　　4.放线菌YJ1无菌发酵液及其粗提物对油菜菌核病的防治
　　室内防病试验结果表明，放线菌YJ1无菌发酵液及其粗提物标准液通过浸种、灌根、喷雾及油菜离体叶片试验，都能够在一定程度上抑制油菜菌核病病斑的扩展。其中，无菌发酵液和粗提物标准液浸种处理的防效最高分别达85.24％、65.04％;灌根处理(15d)的防效分别为59.54％、57.80％;喷雾处理的防效分别为60.00％、55.65％;离体叶片试验中，喷雾后立即接种的防效最好，分别为68.07％、55.42％。

目录

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摘要

第一章 文献综述

1 油菜菌核病研究概况

1．1 油菜菌核病的症状和危害

1．2 油菜菌核病的病原

1．3 病害发生规律

1．4 防治措施

2 生防放线菌研究概况

2．1 放线菌概述

2．2 放线菌在自然界中的分布

2．3 放线菌的生防机制

3 放线菌次级代谢产物研究概况

3．1 放线菌次级代谢产物

3．2 放线菌活性产物分离提纯的方法

4 农用抗生素

5 本研究的目的及意义

第二章 放线菌YJ1活性产物的分布及理化性质研究

1 材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 供试菌株

1．4 供试培养基

2 方法

2．1 生物活性测定

2．2 液体发酵培养

2．3 活性产物在发酵液中的分布

2．4 活性产物酸碱稳定性测试

2．5 不同pH条件下的热稳定性测试

2．6 萃取条件和极性的初步研究

3 结果与分析

3．1 活性产物在发酵液中的分布

3．2 酸碱稳定性测试

3．3 不同pH条件下的热稳定性测试

3．4 萃取条件和极性的初步研究

4 讨论

第三章 放线菌YJ1活性代谢产物的分离纯化

1 材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 供试菌株

1．4 供试培养基

2 方法

2．1 发酵液的预处理

2．2 发酵液中活性产物的萃取

2．3 薄层层析条件探索

2．4 硅胶柱层析分离

2．5 薄层层析产物制备

2．6 高效液相色谱分析与制备

3 结果与分析

3．1 发酵液预处理

3．2 薄层层析条件探索

3．3 硅胶柱层析分离

3．4 薄层层析产物制备

3．5 高效液相色谱分析与制备

3．6 活性产物分离纯化工艺

4 讨论

第四章 放线菌YJ1发酵液粗提物对油菜菌核病的防治

1 材料

1．1 主要仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 试材料

1．4 供试培养基

2 方法

2．1 粗提物的制备

2．2 粗提物毒力测定

2．3 浸种对油菜菌核病的防治

2．4 灌根对油菜菌核病的防治

2．5 喷雾对油菜菌核病的防治

2．6 油菜菌核病的离体叶片防治

2．7 抑菌谱测定

3 结果与分析

3．1 粗提物毒力测定

3．2 浸种对油菜菌核病的防治

3．3 灌根对油菜菌核病的防治

3．4 喷雾对油菜菌核病的防治

3．5 油菜菌核病的离体叶片防治

3．6 抑菌谱测定

4 讨论

参考文献

致谢

附图