苦胆链霉菌Streptomyces felleus的诱变选育及其对油菜菌核病的生物防治

摘要

油菜菌核病是一种世界性的真菌病害，严重影响着油菜生产，具有土传和气传病害的特点，其病原为Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary。本试验通过对生防放线菌苦胆链霉菌Streptomyces felleus YJ1的诱变选育，以期寻求对油菜菌核病具有较高拮抗活性的突变菌株。同时，探究了出发菌株YJ1及高效突变菌株对油菜菌核病菌的抑制作用，并优化了菌株的发酵条件;测定了拮抗放线菌对油菜抗病相关酶的影响，并进行了室内盆栽、离体叶片及大田防效等试验，为生防菌的进一步开发利用提供了理论依据。其主要研究结果如下:
　　1.生防放线菌YJ1的诱变选育
　　利用紫外线、硫酸二乙酯(DES)及二者相结合的复合诱变对生防菌YJ1进行了诱变选育。比较这3种诱变方法的诱变效应，DES是菌株YJ1的最佳诱变剂。通过对突变菌株的摇瓶发酵筛选，最终得到2株对核盘菌菌丝生长抑制活性最大的突变菌株Y-60.16和Y-Y-13，抑菌率分别为89.55％、89.09％，比出发菌株分别提高了11.55％、10.96％。突变菌株Y-60.16、Y-Y-13经连续传代10次，它们对病原菌的抑制活性无明显变化，其遗传稳定性良好。
　　2.生防菌YJ1及其突变菌株对油菜菌核病菌的抑制作用
　　生防放线菌YJ1及突变菌株Y-60.16、Y-Y-13对油菜菌核病菌的拮抗带宽分别为11.0 mm、12.3 mm、12.1 mm，其抑菌率分别为80.28％、89.55％、89.09％。这3株放线菌能够明显抑制病菌产生菌核，甚至在病菌培养11d后仍有较高的抑制率，分别为79.05％、81.42％、76.28％。此外，这3株放线菌的无菌发酵液能够抑制病菌菌核和子囊孢子的萌发，但随着发酵液浓度的降低，其抑菌效果有所下降。
　　3.生防菌YJ1及其突变菌株发酵条件的优化
　　为了提高生防放线菌YJ1及其突变菌株的发酵水平，经单因素试验和正交试验对它们的发酵条件进行了优化。菌株YJ1的较优发酵培养基组成为:玉米粉10g，硫酸铵3 g，K2HPO40.75 g，MgSO40.75 g，NaCl0.5 g，FeSO40.01 g，蒸馏水1000 mL;理想发酵条件为:初始pH7.0，发酵温度28℃，发酵时间4d，摇床转速160 r/min。菌株Y-60.16的发酵培养基:玉米粉20 g，黄豆饼粉3 g，K2HPO40.25 g，MgSO40.5 g，NaCl0.5 g，FeSO40.01 g，蒸馏水1000 mL;理想发酵条件:初始pH7.0，发酵温度28℃，发酵时间5d，摇床转速160 r/min。菌株Y-Y-13的发酵培养基;玉米粉20 g，硫酸铵1g，K2HPO40.5 g，MgSO40.75 g，NaCl0.5g，FeSO40.01 g，蒸馏水1000mL;理想发酵条件:初始pH7.0，发酵温度28℃，发酵时间4d，摇床转速160 r/min。
　　4.生防菌YJ1及其突变菌株能提高油菜抗病相关醇的活性
　　生防放线菌YJ1及突变菌株Y-60.16、Y-Y-13能够显著提高油菜SOD、POD、PPO和PAL的活性。这几种酶的变化无明显的数量关系，并且随时间变化的规律也不相同，尤其是在处理4d后这几种酶的活性都保持在较高水平。由此可知，诱导油菜的系统抗性可能是这几株菌的生防机制之一。
　　5.生防菌YJ1及其突变菌株的防病效果
　　室内试验结果表明，放线菌发酵液用于浸种、灌根或浸根、喷雾以及油菜离体叶片试验，都能够显著控制油菜病菌病斑的扩展。其中，菌株YJ1、Y-60.16和Y-Y-13发酵液喷雾处理的相对防效分别为79.91％、75.00％、80.80％;离体叶片试验的防效分别为81.42％、86.19％、88.52％。在大田试验中,Y-60.16、Y-Y-13的防治效果分别为59.35％、55.89％，高于出发菌YJ1的47.56％，可见这两株放线菌可作为油菜菌核病生物防治的候选菌株。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 油菜菌核病概况

1．1 油菜菌核病症状

1．2 油菜菌核病病原

1．3 油菜菌核病的发病条件及病害循环

1．4 油菜菌核病的防治措施

2 生防放线菌研究现状

2．1 放线菌概述

2．2 放线菌的生防拮抗机制

2．3 放线菌在植物病害生物防治中的应用

2．4 放线茵在应用中存在的问题及展望

3 微生物诱变育种

3．1 微生物诱变育种的概念和作用

3．2 微生物诱变育种的方法

4 微生物发酵

5 本研究的目的及意义

6 技术路线

第二章 生防放线菌的诱变选育

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 紫外诱变筛选结果

3．2 硫酸二乙酯(DES)诱变筛选结果

3．3 紫外线和硫酸二乙酯(DES)复合诱变的筛选结果

3．4 各种诱变方法诱变效应评价

3．5 三种诱变方法诱变效应的比较

3．6 突变菌株的遗传稳定性

4 讨论

第三章 生防放线菌发酵条件的优化

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 发酵培养基的筛选

3．2 发酵条件的优化

4 讨论

第四章 生防放线菌对油菜菌核病病菌的抑制作用

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 放线菌及其发酵液的抑菌活性

3．2 放线菌对核盘菌菌丝形态的影响

3．3 放线菌对菌核形成的抑制作用

3．4 放线菌对菌核萌发的抑制作用

3．5 发酵液对子囊孢子萌发的影响

4 讨论

第五章 生防放线菌对油菜抗病相关酶的影响及其对油菜菌核病的防治

1 前言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 油菜抗病相关酶活性的变化

3．2 放线菌浸种对油菜菌核病的防治

3．3 放线菌灌根与浸根对油菜菌核病的防治

3．4 发酵液喷雾对油菜菌核病的防治作用

3．5 发酵液对核盘菌在油莱离体叶片的防治作用

3．6 田间试验

4 讨论

参考文献

致谢

附图

攻读学位期间发表的学术论文