鸡传染性支气管炎病毒Sczy3 S1蛋白中和性单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

摘要

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitism，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起鸡的一种高度传染性呼吸道疾病，IB可以感染所有日龄的鸡，能在多种组织细胞中复制，引发呼吸道疾病、腹泻和产蛋量下降等，给造成养禽生产带来巨大的经济损失。在这项研究中，通过制备针对QX型IBV毒株-Sczy3S1蛋白的单克隆抗体，并用该单克隆抗体对Sczy3 S1蛋白的抗原表位进行定位研究，进一步认识S1蛋白的分子结构和抗原表位结构，为研究表位疫苗和基于表位的诊断试剂提供科学依据。
　　本研究首先对Sczy3 S1蛋白进行生物信息学分析，结果表明S1蛋白结构的二级结构以β-折叠和转角为主，并有少量无规则区域;含有较多的两亲性α-螺旋和β-折叠区域，柔性区域和表面可及性区域，有较好的免疫原性。选择抗原性较强的区域81 aa-422aa，建立了Sczy3 S1原核表达载体，进行原核表达。扩增其核苷酸序列并克隆至pET-32a(+)载体中，将阳性重组质粒pET-32-S1转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后，SDS-PAGE检测重组表达蛋白His-S1，成功表达出了大小约为57.5kDa的重组蛋白。表达蛋白His-S1经IPTG诱导浓度优化和诱导时间优化后，大量表达，用HisTrap FF crude亲和层析纯化，纯化效果达到90％以上。用BABL/c鼠抗Sczy3高免血清与重组蛋白His-S1做Western blot分析，结果表明重组蛋白与鼠抗Sczy3高免血清有较好的反应性，可用于针对S1蛋白单克隆抗体的筛选。
　　利用差速离心法纯化IBV Sczy3全病毒作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，并用BALB/c鼠高免血清和BALB/c鼠阴性血清建立ELISA检测方法。Sczy3病毒免疫BALB/c鼠4次后，取脾脏与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，融合的诱导剂为PEG1500，共进行3次融合。融合细胞首先用Sczy3纯化病毒为包被抗原ELISA检测，筛选出Sczy3阳性单克隆抗体;Sczy3阳性单克隆抗体用重组蛋白His-S1作为包被抗原第二轮His-S1-ELISA检测，筛选出针对Sczy3 S1蛋白的阳性单克隆抗体。阳性单抗用Sczy3和重组蛋白His-S1经过Western blot方法检测，最终获得了两株能够稳定分泌IBV S1蛋白单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株1D5和6A12。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒检测两株单克隆抗体均为IgM亚型。与AIV(H5、H9亚型)、NDV ELISA反应，mAbs1D5和6A12特异性良好。与其他10株IBV毒株ELISA反应，mAbs1D5和6A12具有交叉反应性，mAb1D5与CK/CH/SCYA/10I和CK/CH/SCMY/10I的反应性低，比6A12交叉反应性差。
　　Sczy3的第8代尿囊液病毒接种CEK细胞，建立Sczy3 CEK细胞适应株Sczy3-C。Sczy3-C第20代测定TCID50，结果为10-5.64/0.2 mL。终点法中和试验测定mAbs1D5和6A12的中和性，mAbs1D5和6A12都具有中和性，mAb1D5的中和效价为1∶40.6，mAb6A12的中和效价为1∶44.7。制备出的mAbs1D5和6A12是针对Sczy3 S1蛋白的中和性单克隆抗体。
　　为了鉴定制备的mAbs1D5和6A12在IBV Sczy3 S1蛋白上所对应的表位，将mAb1D5和6A12作为靶分子包被ELISA板，用噬菌体展示随机12肽库进行生物淘选。经过3轮淘选，每轮增加Tween-20浓度和降低靶分子包被浓度来增加筛选强度。两株单抗均随机挑选10个噬菌体克隆进行扩增和ELISA鉴定，阳性噬菌体PCR扩增获得核心序列并测序。mAbs1D5和6A12均获得3条序列，与Sczy3 S1蛋白比对序列发现mAb1D5的共有序列与S1蛋白87-PPQGMAW-93一致，mAb6A12的共有序列与S1蛋白412-IQTRTEP-418一致。同源性分析发现，87-PPQGMAW-93在分属8个基因型32株IBV中变异性较大，特别是与CK/CH/LSC/99I-Type、Proventriculus-Type和TW-Type的差异性较大;而412-IQTRTEP-418在8个基因型中较保守，与JP-Type的差异较大。原核表达含有抗原表位的S1蛋白短肽pET-se1(77aa-107aa)和pET-se2(399aa-424aa)，利用mAbs1D5和6A12分别对表达产物进行Western blot分析，结果显示，表达的融合蛋白pET-se1可被mAb1D5特异性识别，pET-se2可被mAb6A12特异性识别，由此表明87-PPQGMAW-93和412-IQTRTEP-418为IBV Sczy3 S1蛋白的两个线性中和性B细胞抗原表位。
　　该实验结果丰富了IBV S1蛋白的中和性单克隆抗体库，从分子水平上阐明了IBVS1蛋白的抗原结构，有利于进一步了解IBV S1蛋白抗原结构和功能的关系和遗传变异机制，为研究新型表位疫苗和表位诊断方法的建立夯实基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一部分 文献综述

第一章 文献综述

1 鸡传染性支气管炎

2 B细胞抗原表位的研究

3 研究的目的和意义

第二部分 试验研究

第二章 鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白的原核表达

1 试验材料

2 试验方法

3 结果

4 讨论

第三章 Sezy3 S1蛋白中和性单克隆抗体的制备

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 Sczy3 S1蛋白中和性抗原表位的定位

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

第三部分 结论

参考文献

致谢

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