用于诊断四种禽呼吸道疫病病毒可视化芯片的构建及初步应用

摘要

禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎和传染性喉气管炎是鸡群常见的四种呼吸道疫病。它们的发病症状和剖解病理变化相似，病死率较高，给养鸡业带来严重的经济损失。因此，对于四种疫病的鉴别诊断对防控具有重要意义。本研究是在传统基因芯片技术的基础上结合不对称PCR技术，将生物素标记的不对称PCR扩增产物与寡核苷酸芯片杂交，然后与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)包被的链霉亲和素反应，用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)对该杂交体系显色后，阳性信号能够以肉眼可见的棕色斑点呈现。该研究建立的可视化寡核苷酸基因芯片技术可以对禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性喉气管炎进行同时鉴别诊断，为鸡呼吸道疫病的临床诊断提供了新的技术。
　　1.AIV的NP基因重组质粒的构建及寡核苷酸探针的设计
　　根据Genbank中收录的基因序列，对AIV的保守基因NP，设计一对特异性引物，目的片段的长度为272 bp。以分离株H9为材料提取RNA，经反转录得到cDNA。然后以cDNA为模板，经PCR扩增获得NP基因扩增产物。将所获得的PCR产物经胶回收后与pMD19-T载体连接，然后转化到大肠杆菌DH5α，经PCR扩增和核酸序列测定鉴定，成功克隆出AIV-NP基因的重组质粒;同时成功复苏本实验室前期保存的NDV的F基因、IBV的N基因和ILTV的TK基因的冻干重组质粒菌。
　　以AIV-NP、NDV-F、IBV-N和ILTV-TK靶基因核酸序列片段的正义链为模板，用Oligo7.0软件设计两条寡核昔酸探针，长度为40 bp左右，Tm值为80℃左右，探针经BLAST分析，确定各探针的特异性良好。
　　2.AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片的构建及条件优化
　　基因芯片的制备:用微阵列芯片喷样系统晶芯(@)SmartArrayerTM16在尼龙膜上喷制芯片。喷制前先将尼龙膜在超纯水中浸泡30 min待干燥后，将寡核苷酸探针与点样缓冲液充分混合，调整探针到合适浓度后，将探针点制到芯片上，待探针完全固定后，在紫外灯下交联30 min，然后将制备好的芯片在4℃下密封保存。
　　不对称PCR扩增技术:优化生物素标记的上游引物与未标记的下游引物的浓度比例，提高扩增的循环次数，控制模板浓度，用高浓度的琼脂糖凝胶在低电压条件下检测扩增的单链情况。结果表明，在反应体系中当生物素标记的上游引物与下游引物在10∶1时，所获单链产物最多。
　　芯片制备与检测技术条件的优化:对芯片制备和芯片检测技术中的各项检测条件进行优化。结果表明:当喷样次数为1次;探针浓度为25μM;杂交时间为1 h;杂交温度为50℃;浓度为1.0mg/mL Streptavidin HRP Conjugate稀释2000倍;DAB显色时间为5 min时，芯片检测技术的结果最佳，确立了共检芯片技术检测的标准条件。
　　3.AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检可视化芯片的质量评价
　　本研究对构建的AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片进行了特异性、敏感性和保存期研究。结果表明，本研究所构建的芯片特异性良好;敏感性试验结果显示最低可检测出靶基因浓度为1.0×10-5μg/μl;随机抽取保存不同时间的3张芯片进行检测，结果该芯片在保存180 d时仍可检测;采用本研究所构建的可视化芯片技术和实验室常规的RT-PCR/PCR技术同时对采自川渝地区的96份临床组织样品进行检测，结果两种方法的检测结果符合率为100％。本研究构建的AIV-NDV-IBV-ILTV共检可视化芯片，为鸡病诊断提供了新的技术。

目录

论文说明

声明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．四种禽呼吸道疾病及其病原学特征

1．1 禽流感概述

1．2 新城疫概述

1．3 鸡传染性支气管炎概述

1．4 鸡传染性喉气管炎概述

2．禽呼吸道疾病的常见诊断方法

2．1 病毒分离及电镜观察

2．2 免疫学诊断方法

2．3 分子生物学诊断方法

3．传统基因芯片技术在鸡疫病检测方面的应用

3．1 基因表达谱分析

3．2 基因分型检测

3．3 疾病诊断

4 可视化芯片应用的研究进展

4．1 可视化基因芯片的研究原理

4．2 可视化芯片技术的应用研究

5．本研究的目的与意义

第二章 AIV-NP重组质粒的构建及靶基因的复苏

1 材料

1．1 生物材料

1．2 主要试验仪器

1．3 主要试剂

2 方法

2．1 AIV的NP基因重组质粒的构建

2．2 靶基因的复苏及验证

3 结果与分析

3．1 AIV-NP基因PCR鉴定结果

3．2 AIV-NP基因重组质粒PCR鉴定结果

3．3 AIV-NP基因测序及同源性分析结果

3．4 靶基因复苏验证结果

4 讨论

4．1 靶基因的选择

4．2 靶基因长度的选择

4．3 靶基因的验证

5 小结

第三章 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化芯片的构建及评价

1 材料

1．1 生物材料

1．2 主要试验仪器

1．3 芯片杂交材料与试剂

1．4 其他主要材料与试剂

1．5 临床样品

2 方法

2．1 寡核苷酸探针设计和合成

2．2 芯片的制备

2．3 不对称PCR引物浓度的优化

2．4 可视化芯片检测的步骤

2．5 可视化基因芯片的优化

2．6 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检芯片有效性评价

3．2 探针基因重复喷样次数选择结果

3．3 寡核苷酸探针喷样浓度选择结果

3．4 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化芯片杂交温度的优化结果

3．5 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化芯片杂交时间优化结果

3．6 Streptavidin HRP Conjugate稀释倍数的优化结果

3．7 底物显色时间优化结果

3．8 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检基因芯片的有效性

3．9 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检基因芯片的特异性

3．10 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检基因芯片的灵敏性

3．11 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检基因芯片的保存期

3．12 AIV-NDV-IBV-ILTV可视化共检芯片的临床应用

4 讨论

4．1 关于不对称PCR技术的讨论

4．2 关于可视化芯片的条件优化的讨论

4．3 关于可视化芯片质量评价的讨论

4．4 关于可视化芯片临床应用的讨论

5 小结

研究创新点

参考文献

致谢

附录

攻读硕士期间发表的论文