玉米红轴基因C(t)和矮秆基因d125的克隆及表达分析

摘要

不断创制玉米新的突变体并进行遗传鉴定与利用研究是玉米育种中的重要工作，课题组前期通过多种遗传途径创制了一批新的玉米种质资源，并对红轴突变体698-3R和矮秆突变体K125d做了表型鉴定、遗传分析和基因定位研究，将控制2个突变性状的基因暂命名为C(t)和d125。本研究在已有研究的基础上，通过等位性测验、PCR扩增克隆的方法鉴定突变基因，并对其表达进行分析，具体结果如下:
　　1、红轴基因C(t)的等位性测验、克隆及表达分析结果
　　(1)通过C(t)与P1等位性测验发现，组合698-3×107H表现为与两亲本一致的白轴表型，而(698-3×698-3R)×107H表现为红白轴1∶1分离，说明轴色遗传符合一对基因模型，C(t)与P1基因等位。
　　(2)以P1的cDNA序列为模板克隆C(t)发现，红轴698-3R存在3个转录本，白轴698-3中至少存在2个转录本;增强子克隆发现，698-3R增强子区域可能有1个长度约为700bp片段的插入，说明可能会对C(t)的表达水平产生影响;预测蛋白的氨基酸序列比对发现，698-3R的3个蛋白中仅有698-3R-P-2在C末端有1个丙氨酸(A)插入，698-3R-P-1和698-3R-P-3与已知的P1-wr蛋白的氨基酸序列完全一致，且预测的3个蛋白均具有完整的MYB结构域和酸性激活域，而白轴的698-3-P-1由于缺失移码突变不具有该功能结构，表明698-3R的3个转录本预测的蛋白可能与P1-wr蛋白功能一致，而与698-3的转录本预测的蛋白的功能可能不一样。
　　(3)对5、10、15、20和25DAP的穗轴中C(t)表达分析发现，各时期中，C(t)在698-3R中表达量均高于698-3，除了25DAP外，其余4个时期差异均显著或极显著;对受P1调控的A1、C2和Chi1基因表达分析发现，基因C(t)与A1和C2的表达趋势一致，而与Chi1不一致，说明C(t)具有P1调控A1和C2基因的功能，Chi1基因可能还受其他路径的调控。
　　综上，控制红轴698-3R的C(t)是一个P1-wr基因，C(t)的增强子插入可能是差异表达的主要原因，完整的功能域可能是调控A1和C2基因的重要基础。
　　2、矮秆基因d125的克隆及表达分析结果
　　(1)以Br2的DNA序列为模板克隆d125发现，d125的编码序列在起始密码子ATG后第3868个碱基处有一个长度为241bp片段缺失，并插入一个9bp的片段，导致移码突变。对预测的K211-P和K125d-P蛋白结构和功能分析发现，2个蛋白均具有完整的12个跨膜结构域，移码突变区段的二级结构发生了改变，如α-螺旋结构等，移码突变区段位于PGP和ABC转运蛋白的核酸结合域内，但仍具有完整的ABC结构，而缺失区段含有保守的功能位点，与底物结合和转运相关。因此，由于缺失移码突变导致保守的功能位点缺失和蛋白二级结构改变，可能使K125d-P蛋白与底物结合或转运受阻，影响了蛋白转运功能。
　　(2)对d125在8、10、12和14叶龄期的茎秆第二节间的表达分析发现，d125表达量仅在8叶期K125d极显著高于K211，其余时期差异不显著，但K211的株高从9叶期开始显著高于K125d，此时d125表达量无显著差异，说明株高可能不受d125表达水平上的调控。
　　综上，Br2位点缺失造成移码突变可能是影响d125致矮的主要原因。

目录

声明

摘要

中英文缩写对照

1文献综述

1．1种质资源研究的意义

1．2玉米轴色基因P1的研究进展

1．2．3玉米P1基因编码一个MYB转录调控因子

1．2．5P1基因调控玉米鞣红色素积累

1．3玉米矮秆基因br1的研究进展

1．4玉米矮秆基因br2的研究进展

1．4．1玉米矮秆基因br2的发现及应用研究进展

1．4．2玉米矮秆基因br2的定位及克隆研究进展

1．4．3 Br2编码一个PGP蛋白

1．4．4玉米矮秆基因br2的表达研究进展

1．5等位性测验的方法

1．6基因克隆技术

1．6．1功能克隆

1．6．2图位克隆

1．6．3表型克隆

1．6．4 PCR扩增克隆

1．6．5序列同源性克隆

1．6．6 DNA芯片技术克隆

1．7基因功能预测方法

1．7．1基因的生物信息学分析

1．7．2基因的表达谱分析

2研究内容及目的意义

3材料与方法

3．1供试材料

3．3．1克隆引物设计

3．3．2总RNA提取及cDNA合成

3．3．3全基因组DNA的提取

3．3．4 PCR反应及检测

3．3．5目的片段的克隆及测序

3．4 qRT-PCR实验设计

3．4．1实验设计

3．4．2 qRT-PCR引物设计及内参选择

3．4．3总RNA提取及cDNA合成

3．4．4 qRT-PCR

4结果分析

4．1．2 C(t)克隆结果分析

4．1．3 C(t)的qRT-PCR结果分析

4．2矮秆基因d125克隆及表达分析

4．2．1 d125克隆结果分析

4．2．2 d125的qRT-PCR结果分析

5讨论与结论

5．2．1红轴基因C(t)的序列及功能预测分析

5．2．2矮秆基因d125序列及功能预测分析

5．3．1 C(t)表达模式分析

5．3．2 d125表达分析

5．4突变体材料的应用前景分析

参考文献

附录

致谢

作者简历