长期多代饮奶对鼠小肠乳糖酶活性及mRNA水平的影响研究

摘要

世界范围内大多数无饮奶传统种族在其断奶1～2年以后，肠道乳糖酶都会逐渐下降到一个较低水平，并且维持终生，即发生成人型乳糖不耐受(adult-typehypolactasia)。乳糖不耐受的发生有多种危害，除了影响乳品中Ca，P,Mg等的吸收利用外，还可直接导致多种疾病的发生。目前对于乳糖不耐受的研究很多，但其发生机制仍不很清楚，而且多选用猪、狗、家兔、大鼠作为实验动物。为了通过多代繁殖实验，来探讨乳糖不耐受的机制，我们首次选用了繁殖周期相对较短、遗传背景均一的近交系BALB/c小鼠作为繁殖实验的研究对象，并对这一品系小鼠乳糖酶的编码基因进行了初步研究。 本文做了以下四部分的工作：1BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac的克隆及序列分析1.1方法1.1.1BALB/c小鼠乳糖酶基因的克隆：取4周龄BALB/c小鼠空肠段小肠组织，提取组织总RNA，以人和大鼠乳糖酶基因为参考，利用生物学软件Primer5.0设计特异PCR引物，逆转录法合成cDNA第一链，梯度PCR扩增小鼠乳糖酶编码基因。 1.1.2pNEB-Lac重组质粒的构建：PCR产物和克隆载体pNEB193分别经EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶消化，DNA连接酶连接，转入E.coliTB1感受态细胞，重组子经筛选和鉴定后对插入的目的基因进行测序，测序结果提交GenBank核酸数据库。 1.1.3BALB/c小鼠乳糖酶基因的序列分析：利用NCBIBLAST，Omiga2.0等生物学软件对克隆基因的性质及功能进行分析预测。 1.2结果1.2.1本研究克隆的BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac编码区共有912bp，起始密码为ATG，编码303个氨基酸残基。 1.2.2序列已提交NCBIGenBank，登录号AY751548。1.2.3经预测，所编码的蛋白质的化学性质如下：蛋白：乳糖酶；长度：303aa；分子量：34.113KDa；等电点(pI)：8.676等。 1.2.4所编码的蛋白二级结构中，存在一个糖苷键水解酶F1，该基序位于N端121-129位氨基酸之间，其氨基酸序列为IYVTENGVS。 1.2.5在酶蛋白的C末端存在一个跨膜螺旋结构，这一预测与文献报道人的乳糖酶通过C末端的跨膜肽段锚定在小肠微绒毛刷状缘结果相一致。证明我们克隆的基因结构和功能与人的乳糖酶相同。 1.2.6BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac与C57BL/6J小鼠的XM1294793序列同源性为99％，与大鼠LctcDNA序列同源性为88-89％，与人LctcDNA同源性为83％。 1.3结论1.3.1成功克隆BALB/c小鼠乳糖酶cDNALac； 1.3.2成功构建BALB/c小鼠乳糖酶编码基因Lac克隆载体pNEB-Lac。 1.3.3小鼠乳糖酶基因在人和大鼠基因组中具有同源序列。 2小鼠乳糖酶cDNA探针标记及酶活性测定方法的研究2.1材料与方法2.1.1标记用cDNA来自第一部分克隆的小鼠乳糖酶编码基因并经BamHⅠ内切酶水解后得到的318bp保守核酸片段。 2.1.2采用随机引物法地高辛标记LaccDNA探针。标记用试剂盒为德国Roche公司的“随机引物DigHighPrimeDNALabelingangDetectionStarterKit1”。 2.1.3探针灵敏度检测用武汉博士德公司产的敏感性加强型原位杂交检测试剂盒。 2.1.4乳糖酶测定方法在Dahlqvist方法基础上改良。 2.2结果2.2.1经检测标记探针灵敏度达到0.1pg。 2.2.2乳糖酶测定最适的底物溶液pH值为4.6(小鼠)，5.6(大鼠)。反应的最佳条件为：水浴反应75min，显色45min，显色剂(TGO)用量为3.0ml。 2.3结论2.3.1本部分标记的核酸分子探针具有较高的灵敏度。 2.3.2本研究建立的小鼠乳糖酶测定方法具有很好的精确度和重复性。 3长期多代饮奶对BALB/c小鼠小肠黏膜乳糖酶活性的影响3.1目的通过多代繁殖实验探讨长期不间断饮奶对小鼠小肠黏膜乳糖酶活性的影响，以及可能的分子机制。 3.2方法按第二部分执行，其中，mRNA采用原位杂交测定，分析采用半定量法(灰度分析)。 3.3结果3.3.1无论在断奶组或饮奶组，原代不同年龄段小鼠小肠黏膜乳糖酶活性均不同，其中3wk龄鼠乳糖酶活性最高，5、7wk龄显著下降，9wk龄最低，说明小鼠在断乳后，乳糖酶活性随年龄增大而明显下降。 3.3.2子一代小鼠与原代相似，均呈现成年后乳糖酶活性下降的现象；且相同年龄组两代之间无统计学差异，断奶组或饮奶组之间也无统计学差异。 3.3.3子二代7wk龄小鼠乳糖酶活性与断乳前小鼠(3wk)无统计学差异；而与7wk龄断奶组、原代7wk龄饮奶组都出现了统计学差异，p＜0.05，说明三代长期饮奶能使子二代7wk龄小鼠乳糖酶活性维持在一定水平。 3.3.4原位杂交后经灰度分析发现，各代、各组间，乳糖酶mRNA水平未出现统计学差异。 3.3.5从细胞图谱看，小鼠乳糖酶mRNA存在于小肠绒毛底部，沿肠线(隐窝轴)分布。 3.4结论34.1通过多代不间断饮奶，对维持乳糖酶活性有益。 3.4.2乳糖酶基因的调控，可能发生在翻译水平或后翻译水平，而并非在转录水平上调节。也就是说，乳糖酶基因在转录了高量的mRNA后，在由mRNA向乳糖酶蛋白翻译的过程，或者由乳糖酶蛋白前体向乳糖酶的活性形式转变的过程中，出现了下调机制。 3.4.3由于本研究繁殖动物的代数不够多，因此，是否在4、5、6……代之后，会出现其他的情况，如乳糖酶mRNA水平有了某种变化，而这种变化的意义是什么，还有待于今后的研究。 4SD大鼠乳糖酶在小肠中分布情况的研究4.1材料与方法选3-4wk龄SD大鼠15只，自十二指肠下连续剪取三段，每段约10cm，分别测定乳糖酶活性及乳糖酶mRNA水平。 4.2结果4.2.1乳糖酶活性结果，经方差分析，三段之间存在差异，说明从十二指肠起，小肠乳糖酶活性逐段降低。可消化乳糖的乳糖酶应主要分布在小肠上段。 4.2.2三组间，乳糖酶mRNA水平未出现差异。 4.2.3从细胞图谱看，SD大鼠乳糖酶mRNA除主要沿肠线分布外，肠绒毛上也有不少散在的分布。 4.3结论本部分结果显示，乳糖酶的消化应在小肠上段。而mRNA水平未显示出统计学差异，进一步佐证了第三部分的结论，即乳糖酶基因的调控可能发生在翻译或后翻译阶段。 总结本研究首次选用近交系小鼠作为实验动物研究乳糖不耐受的调控机制，成功克隆了BALB/c小鼠乳糖酶编码基因Lac，并构建5pNEB-Lac重组载体。利用生物信息学技术对Lac基因的结构、功能进行了序列分析，为研究乳糖不耐受提供了一个新的途径。 动物实验结果表明，长期不间断饮奶，有可能对于维持乳糖酶的活性有益。而乳糖酶基因的表达调控并非发生在转录水平，可能发生在mRNA→乳糖酶蛋白→乳糖酶活性形式这一翻译和/或后翻译过程。SD大鼠乳糖酶活性在小肠分布情况的研究，证明自十二指肠以下，乳糖酶活性逐段下降，同时还证实了小鼠研究得出的乳糖酶基因调控机制。

目录

前 言

第一部分BALB/c小鼠乳糖酶mRNA的提取及其cDNA重组体的构建、测序

前言

材料与方法

结果

1.BALB/c小鼠小肠组织总RNA提取

2.BALB/c小鼠Lac cDNA RT-PCR圹增结果

3.pNEB-lac重组质粒的构建

4.测序结果

5.BALB/c小鼠Lac cDNA序列已被GenBank收录，登录号：AY751548

6.BALB/c小鼠Lac cDNA序列同源性分析

7.BALB/c小鼠Lac编码产物

8.BALB/c小鼠Lac编码产物的同源性分析

9.BALB/c小鼠Lac编码产物的性质预测

10.BALB/c小鼠Lac编码产物二级结构及功能结构预测

11.BALB/c小鼠Lac编码产物三级结构预测

讨论

参考文献

第二部分小鼠乳糖酶cDNA探针标记及酶活性测定方法的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分BALB/c小鼠多代饮奶对乳糖酶活性及mRNA水平的影响研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分SD大鼠乳糖酶在小肠中分布情况的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

综述 乳糖不耐受分子机制研究进展

参考文献

致谢

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