华南虎、东北虎、孟加拉虎的D-loop、ND5、16S rRNA、Cyt b序列及其在系统进化研究中的应用

摘要

本研究用线粒体基因组中的两种功能不同的蛋白质编码基因(细胞色素b(Cytb)和NADH-泛醌还原酶亚基5(ND5))和16SrRNA以及非编码区(D-loop)作为分子标记，分析了它们在虎亚种中的适用性，并用它们初步分析了华南虎、东北虎和孟加拉虎的相互关系。　　通过PCR，本文获得了华南虎、东北虎和孟加拉虎的Cytb基因的572bp片段，ND5基因的309bp的片段、16SrRNA的326bp的片段和D-loop高变区Ⅰ(HSVⅠ)的约500bp的片段。经过序列分析，发现一只东北虎Pts01的Cytb序列与其他虎的Cytb序列间的遗传距离远远大于其他虎的Cytb序列间的遗传距离。同样，一只孟加拉虎Ptt1的16SrRNA与其他虎的16SrRNA序列间的遗传距离远远大于其他虎的16SrRNA序列间的遗传距离序列，所以把这2段序列排除在分析以外。　　根据D-loop序列分析，我们发现在D-loop高变区Ⅰ中华南虎与金钱豹、雪豹的遗传距离要小于东北虎、孟加拉虎与金钱豹、雪豹的遗传距离。结论支持华南虎是最古老的虎亚种的结论。　　通过用扩增D-loop的引物loopR和loopF，我们除了得到目的片段外(500bp)，还得到了287bp的片段。经过Blast软件进行同源搜索发现它属于mtDNA中的D-loop序列，但它是高度保守的：在华南虎、东北虎和孟加拉虎中序列完全一致，在虎与金钱豹中也只有1.76％的序列差异。经过用mtDNA作为模版用loopR和loopF作为引物进行扩增时发现只能得到预期的约500bp的系列，而不能得到这287bp的序列，因此它是转移到核中的似D-loop的线粒体假基因。根据公式δ=(λN+λC)t得出这段假基因大约在16.7百万年前转移到核中。

目录

文摘

英文文摘

引言

1世界虎类现状

2虎的保护

3华南虎、东北虎和孟加拉虎在我国的现状

第一章华南虎、东北虎、孟加拉虎的D-loop序列

摘要

前言

1、材料和方法

1.1材料来源和总DNA提取

1.2 PCR扩增

1.3产物的回收和连接

1.4 JM109高效感受态制备

1.5连接产物的转化

1.6重组质粒的PCR鉴定

1.7重组子的序列测定

1.8序列分析

2、结果

2.1目的序列的扩增

2.2重组克隆的鉴定

2.3序列分析

3、讨论

附表

第二章虎(P.tigris)细胞核中线粒体序列(Numt)的发现及其应用

摘要

前言

1材料和方法

1.1材料来源和总DNA提取

1.2线粒体的分离

1.3线粒体DNA的提取

1.4 PCR扩增

1.5产物的回收和测序

1.6序列分析及进化树

2结果

2.1目的序列的扩增

2.2重组克隆的鉴定

2.3序列分析

2.4 Blast软件搜索结果

2.5系统进化树分析

3讨论

3.1似D-loop的核中的线粒体序列(Numt)的发现

3.2 Numt的应用

3.3估计Numt的转移时间

第三章华南虎、东北虎、孟加拉虎的ND5序列

摘要

前言

1材料和方法

1.1材料和试剂

1.2 PCR扩增

1.3产物的回收和测序

1.4序列分析

2结果

2.1目的序列的扩增

2.2重组克隆的鉴定

2.3序列分析

3讨论

附表

第四章华南虎、东北虎、孟加拉虎、印支虎和苏门答腊虎的Cyt b序列

摘要

前言

1材料和方法

1.1材料和试剂

1.2 PCR扩增

1.3产物的回收和测序

1.4序列分析

2结果

2.1目的序列的扩增

2.2重组克隆的鉴定

2.3序列分析

3讨论

附表

第五章华南虎、东北虎、孟加拉虎的16S rRNA序列

摘要

前言

1材料和方法

1.1材料和试剂

1.2 PCR扩增

1.3产物的回收和测序

1.4序列分析

2结果

2.1目的序列的扩增

2.2重组克隆的鉴定

2.3序列分析

3讨论

附表

第六章华南虎、东北虎、孟加拉虎的系统进化关系

摘要

前言

1材料和方法

1.1材料来源和总DNA提取

1.2 PCR扩增

1.3产物的回收和测序

1.4序列分析

2结果

3讨论

3.1根据Cytb、16S rRNA、ND5和D-loop的系统进化树

3.2 D-loop，ND5，Cytb和16S，rRNA在虎类研究中的适用性

3.3华南虎、东北虎、孟加拉虎之间的进化关系探讨

综述　线粒体DNA（mtDNA）的研究现状

参考文献

在读期间发表的论文

声明

致谢