法医鱼类学种属鉴别初步研究

摘要

目的 法医鱼类学是一门正在兴起的边缘科学，它是在鱼类学、分子生物学、分析化学、生物信息学等基础上，特别是汲取了法医DNA分析的经验发展起来的，旨在对各类案件涉及到的鱼类样本进行鉴定，为案件的侦查与审判提供科学证据。法医鱼类学在鱼类资源科学管理和保护方面有重要作用。本课题旨在研究用于法医鱼类学种属鉴别的新技术。 方法 选择鲤形目的5种珍稀鱼类作为研究对象，它们是胭脂鱼，重口裂腹鱼，岩原鲤，华鲮，四川白甲。另外20种鱼作为研究的对照样本。全部样本采自长江、嘉陵江、雅江以及重庆和成都水产品市场。根据GenBank中鲤鱼的DNA序列资料，利用引物设计软件设计鲤形目控制合成5.8SrRNA和28SrRNA基因间的转录间隔子2(Internal Transcribed Spacer 2，ITS2)DNA区域的通用引物，预计扩增片段包含完整的ITS2及部分编码5.8SrRNA和28SrRNA基因的序列。用通用引物对样本进行PCR扩增，PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，回收。对每种要鉴别鱼类的回收产物进行DNA双向测序。根据测序结果，用系统进化软件(Mega3.1)进行鲤形目鱼类亲缘关系分析。根据鲤形目5种鱼类ITS2序列的不同，设计分别针对每种鱼的种属特异PCR引物。用种属特异引物扩增对应的鱼类样本，纯化PCR产物。将5种珍稀鱼类纯化后的PCR产物等比例混和，作为种属鉴别时的分类标准物。用特异引物和通用引物建立了复合扩增体系，用制备的分类标准物与扩增产物进行琼脂糖电泳比对，建立鱼类复合扩增种属鉴别分类方法。 结果 采用对5.8SrDNA和28SrDNA基因间的转录间隔子2(ITS2)进行PCR扩增和DNA测序的方法，我们得到了中国长江、嘉陵江和雅江流域内5种鲤形目珍稀鱼类测序结果。通过分子进化关系分析，得到了它们之间的亲缘关系图。我们根据测序结果设计筛选出的不同鱼类的特异引物，能对目标鱼类(华鲮、四川白甲、胭脂鱼、岩原鲤、重口裂腹鱼)进行扩增，通过电泳产生种属特异的电泳条带。其中四川白甲扩增产物为245bp，重口裂腹鱼为304bp，华鲮为332bp，胭脂鱼为364bp，岩原鲤为467bp，片段大小相差20bp以上，能够通过琼脂糖凝胶电泳准确区分。 在进行种属鉴别时，通用引物和特异引物组成2对引物，如果它们都能和模板链结合，就会产生2种扩增产物，一种是通用引物的扩增产物，另一种是特异引物的扩增产物。因此如果待测样本是目标鱼类会产生2条带，一条由通用引物扩增产生的带，一条由目标鱼类的特异引物产生的特定的带；而对于属于同一目的非目标鱼类只产生一条由通用引物扩增产生的带；不是同一目的鱼类则无带。 通过优化反应条件，成功实现了7条引物的复合扩增反应，即2条鲤形目鱼类通用引物和5条种属特异性引物在一个PCR扩增管内复合扩增。当检测未知鱼类样本时，由通用引物和种属特异引物复合扩增未知样本，扩增产物与鱼类种属鉴别分类标准物一起凝胶电泳，通过扩增样本产生的电泳条带与鱼类种属鉴别分类标准物电泳产生的条带对比即可达到鉴别目的。 不管是对单一样本的鉴定还是混合样本的鉴定，我们所建立的复合扩增体系都能进行快速、准确的鱼类种属鉴定。实验过程中没有观察到假阴性或假阳性。 本研究建立的方法鉴定结果非常直观，没有鱼类学知识基础的人员也能够根据鱼类种属鉴别分类标准物对鉴定结果进行准确的辨别分类，这克服了一些实验方法要求操作人员要有很强的技术水平的缺点，易于推广使用。 结论 本研究探索了新的鱼类种属鉴定的遗传标记和方法，得出了如下的结论：(1)鱼类DNA链上编码5.8SrRNA基因和28SrRNA基因的序列，在各种目内比较保守，我们利用它的保守性设计了鱼类目的通用引物，通过PCR扩增获得目的DNA片段(包含完整ITS2 DNA片段)，测序获得了鲤形目5种珍稀鱼类的ITS2的DNA序列，为以后的鲤形目鱼类的研究打下了基础。(2)鱼类DNA序列上的转录间隔子ITS2，在各种鱼类的遗传是相对稳定的，而各种属之间有一定的变异。利用它们种内的保守和种间的变异，通过设计种属特异引物能够区分各种鱼类。本课题设计的鲤形目鱼类的特异引物能够对鲤形目的5种珍稀鱼类进行准确的种属鉴别。(3)本课题成功的构建了鱼类电泳分类标准物，可以用于鱼类分类学鉴定。(4)用本课题设计的各种鱼类的特异引物和通用引物建立了复合扩增系统，再加上鱼类电泳分类标准物，我们可以对要鉴别的鱼类进行快速、简单、准确的鉴别，为法医鱼类学种属鉴别提供了新的技术和方法。

目录

前言

第一部分鱼类DNA序列变异初步研究

第二部分鲤形目中不同鱼种属鉴别体系的建立

第三部分鱼类种属快速鉴别方法的初步研究

结论

综述分子生物学技术在水产上的应用

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导师简介

附录

致谢

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