嗜尸性蝇类的分子标记种属鉴别与法医学应用研究

摘要

第一部分、线粒体DNA中COI基因序列在常见嗜尸性蝇类种属鉴别中的应用
　　目的：利用线粒体DNA(mtDNA)细胞色素氧化酶辅酶Ⅰ(COI)中的498bp和841bp基因序列，对常见嗜尸性蝇类进行种属鉴别，解决依据形态学方法难以鉴别现场样本种属的难题，为法医现场检案提供帮助。
　　方法：收集不同地区的2科4属6个种的嗜尸性蝇类样本，经专业人员对样本进行形态学检验，分别提取样本mtDNA，利用COI基因序列中的两对引物进行不同序列PCR扩增，以琼脂糖电泳检测扩增产物，PCR胶回收试剂盒纯化，ABI377测序仪测序，将所得序列以DNAMAN6.0分析软件分别截取498bp和841bp长度的序列，分别输入GenBank进行BLAST检索同源相似性比对，以MEGA5.1软件进行序列分析并构建系统发育树，分析不同地区及不同种属的样本鉴别效果。
　　结果：5个地区6种嗜尸性蝇类30个样本，mtDNA的COI基因序列Ⅰ(498bp) BLAST种属同源性正确比对28个，正确比对率达到93.33％，种内进化分歧均数在0.1％～1.6％之间，种间进化分歧均数在2.2％～11.2％之间，除丝光绿蝇与铜绿蝇2个近缘种属难以区分外，其余4个种属通过系统发育树可明确区分。3个地区6种嗜尸性蝇类36个样本，mtDNA的COI基因序列Ⅱ(841bp) BLAST种属同源性正确比对35个，正确比对率达到97.22％，种内进化分歧均数在0.2％～1.5％之间，种间进化分歧均数在2.7％～10.6％之间，6个种属通过系统发育树均可明确区分。
　　结论：COI基因序列同源性比对与系统发育树构建的种属鉴别方法，是嗜尸性蝇类形态学种属检验的重要补充手段，对嗜尸性蝇类样本种属的快速、准确鉴定有重要作用。
　　第二部分、不同食物成分对大头金蝇生长发育的影响
　　目的：观察不同脏器及不同脂肪含量的肌肉组织对大头金蝇生长发育的影响，为昆虫学相关研究及死后间隔时间(Post mortem interval，PMI)的法医学推断提供理论依据。
　　方法：取猪的脑、心脏、肝脏及肾脏制作4种脏器培养基，同时取肌肉和皮下脂肪组织，按照脂肪含量0％，10％，30％，50％和80％的质量比重，分别制作5种混合食物培养基;在25℃恒温条件下，以不同培养基饲养大头金蝇初孵幼虫，幼虫孵化16h开始每12h取样测量幼虫体长和体重，化蛹后取样测蛹长及蛹重，每次取样10只，同时观察并记录不同阶段的样本数量，计算发育历期，羽化完毕后计算各组幼虫及蛹的死亡率和成虫性别比率，实验重复5次统计各组之间的差异。
　　结果：不同脏器组织对大头金蝇幼虫、蛹及成虫的体长、体重产生明显影响（P＜0.01），与其他3组比较取食肝组织的幼虫生长缓慢（P＜0.01），达到最大体长和体重的时间延迟36 h，其2龄、3龄幼虫期及总发育历期明显大于其他3组(P＜0.01);食物脂肪含量对大头金蝇幼虫、蛹及成虫的体长、体重产生明显影响（P＜0.01），高脂肪组织食物早期可促进幼虫生长，孵化40 h后则抑制其生长并使发育历期缩短（P＜0.01），幼虫及蛹的死亡率增高(P＜0.01);不同组织源食物对成虫的性别比率无明显影响（P＞0.03）。
　　结论：食物成分的不同会对大头金蝇个体大小、生长发育历期及死亡率可产生明显影响，在昆虫学相关研究及法医学检案的PMI推断时应引起足够重视。
　　第三部分、固相微萃取气相色谱质谱法测定大头金蝇样本内的氯氮平
　　目的：建立嗜尸性蝇类样本内氯氮平（clozapine，CLP）的有效定量检测方法，为此类药物中毒死亡案件的法医学检验分析提供帮助。
　　方法：采用固相微萃取结合气相色谱质谱联用(SPME-GC-MS)的方法，以100μm聚二甲基硅氧烷萃取头萃取，洛沙平为内标，气相色谱质谱选择离子方式检测，建立标准曲线，定量检测大头金蝇幼虫及蛹样本内的CLP;分析不同发育时期，取食含有不同浓度CLP的肌肉组织的样本内CLP含量，比较食物与样本体内CLP浓度间的关系。
　　结果：实验建立的SPME-GC-MS法能准确定量检测昆虫样本内的氯氮平，CLP的检出限为0.1 ng/mL，在5～5000 ng/mL范围内线性良好，不同浓度的回收率在93％～104％间，日内及日间精密度(RSD)均小于8％;食物与样本体内CLP浓度间存在明显相关性。
　　结论：SPME-GC-MS法可用于大头金蝇样本体内CLP的检测，该方法简便快捷，精密度好，结果可靠，可用于此类中毒案件中的法医学分析。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 线粒体DNA的COI基因序列在常见嗜尸性蝇类种属鉴别中的应用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分 不同食物成分对大头金蝇生长发育的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分 固相微萃取气相色谱质谱法测定大头金蝇样本内氯氮平

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四部分 嗜尸性蝇类在法医学检案中的应用

法医学案例应用一

法医学案例应用二

全文总结

附图

附录

文献综述 法医昆虫学研究进展

致谢

攻读博士期间发表的论文